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(無題) 削除/引用 No.11131-14 - 2023/01/26 (木) 11:29:57 - 抗体 これまで精製済みの抗体を使用しておりましたが、新たに精製してみたところ、また白く濁るなどの現象が起きてしまいました。proGオープンカラムを使用しております。 ・あるフラクションで急に白く濁る 濃度が高いためかと思いましたが、その前のフラクションより吸光度は低い。 時間が経つと少し濁りは解消されたように見えました、その状態で再度吸光度を測定すると、更に吸光度が低下。 濃度が高いと抗体が凝集して吸光度が下がってしまう？ フラクション中のバッファー組成が影響する？初めの方のフラクションはwash bufferとelution bufferの混じりにより塩が含まれているが、途中からelution bufferのみになり（Cl-はあるがNa＋は含まれていない）、塩がなくなることで抗体が凝集？ 抗体の濃度と、塩濃度が影響しているような気はします。 凝集しない抗体濃度があるのであれば、抗体濃度を薄めて塩なしのバッファーに置換することで対応できるかなと考えております。検討してみます。

(無題) 削除/引用 No.11131-13 - 2023/01/24 (火) 12:23:39 - おお >[Re:12] １さんは書きました : > MES bufferでpH7.0はbufferとして働かないと思う。あれの守備範囲はpH5〜６くらいと思う。 Buffer capacity falls to 33% of the maximum value at pH = pKa ± 1, to 10% at pH = pKa ± 1.5 and to 1% at pH = pKa ± 2. For this reason the most useful range is approximately pKa ± 1. https://en.wikipedia.org/wiki/Buffer_solution https://www.interchim.fr/ft/0/062000.pdf 大抵はpKa ± 1のレンジで使うと生化学の授業で習ったもんです。でMESのpKaは6.16。 Thermo Scientific Chemicals MES, 1.0M buffer soln., pH 7.0なる商品も出回っております。 シグマでは5.5-6.7としているようですが、許容キャパを厳しめにとっているのだと思います。

(無題) 削除/引用 No.11131-12 - 2023/01/24 (火) 11:26:33 - １ MES bufferでpH7.0はbufferとして働かないと思う。あれの守備範囲はpH5〜６くらいと思う。

(無題) 削除/引用 No.11131-11 - 2023/01/24 (火) 11:19:14 - 抗体 使用するバッファーに塩を入れない方が良いことが分かったので、どう対処しようかなと考えているところです。 難しいですね。

(無題) 削除/引用 No.11131-10 - 2023/01/23 (月) 09:45:05 - 抗体 コメントいただきありがとうございます。 実際はまた別のバッファーに置換したいと考えておりまして… Naイオンの量など、計算してみようと思います。

(無題) 削除/引用 No.11131-9 - 2023/01/21 (土) 07:42:14 - おお データーによって若干違いますがIgGのisoelectric point （pI）は６強から８弱。なので抗体によるでしょうけど７付近のpHの溶液で特に塩濃度とか低い場合は沈殿しやすい可能性があるとも言えます。

(無題) 削除/引用 No.11131-8 - 2023/01/21 (土) 02:25:33 - おお ところでHEPESとMESで比べないといけないのでしょうか？MESで大丈夫ならっと思ったりもしますが。HEPESで溶ける状態にするなら前述の机上の空論があっているとするなら、HEPESの濃度と同程度のNaClをくわえるとか、HEPES自体の濃度を上げるとか。 もしかしたらHEPESやMESでpHを合わせるのにNaOHどれくらい入れればいいか計算されたものがあるかもしれませんので、それでNaイオンの量がわかり、必要Naイオンがどれくらいかわかるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.11131-7 - 2023/01/21 (土) 02:18:31 - おお 抗体をそういったコンディションで扱ったことがないので低い塩濃度で沈殿するのかわからないのですが、塩濃度は疑う余地があるかもしれません。 HEPESのpKaは７.５あたりで７に合わすにはHEPESを完全に中和する等モル量は必要なくNaOHでpHを合わせるのにHEPESより低い濃度のNaOHで十分です。 MESはpKaが６.１５なので７に合わすにはMESの濃度以上のNaOHを必要とします。 上記のことからNaイオンはHEPES（pH７）よりMES（pH７）のほうが多くその差が溶ける、溶けないの要因になっているという説明はできるかもしれません。あくまでも机上の空論です。

(無題) 削除/引用 No.11131-6 - 2023/01/20 (金) 23:11:07 - 抗体 皆様、ありがとうございます…！ ･塩濃度に関して 塩濃度が低くなるために凝集する可能性を考えましたが、脱塩して、凝集するバッファーとしないバッファーがあったので関係ないのかなと思っていました ･pHに関して ごもっともです。あまり詳細は書けないのですが、全てpH7.0付近のものを使っております。 ･抗体意外の成分が析出 抗体の純度が高いことは確認できているので、除外していました。 元のバッファーと交換後のバッファーが混ざることで白く濁ることはあるのでしょうか？それに伴い抗体の濃度が低下することと関係がある場合はどのような理由が考えられるでしょうか ･透析前の抗体濃度 透析前はどのように測定しているのか分かりません。が、こちらで透析前の吸光度を測り濃度を算出したところ、記載の濃度とほぼ同じだったので気にしていませんでした。

(無題) 削除/引用 No.11131-5 - 2023/01/20 (金) 19:30:26 - 774R 透析前の抗体の由来が良く分かりませんが、析出したのは抗体以外の成分の可能性はどのように棄却されましたか？ あと、ここの記載だけだと透析前の抗体濃度をどうやって計ったのか？それは正しく抗体のみの濃度を反映しているのかが不明ですが、大丈夫でしょうか？

(無題) 削除/引用 No.11131-4 - 2023/01/20 (金) 19:15:03 - おお バッファーといってもそれだけでなく塩濃度やpHなどでも蛋白の溶解度は変わるものなので詳細な情報が見たい所です。

(無題) 削除/引用 No.11131-2 - 2023/01/20 (金) 17:03:30 - 774R >濃度が半分以上低下する ちょっと何が起きてるか想像が付きませんが、上記の濃度はどのようにして求めましたか？ それから、抗体は具体的にはどのような溶液組成でしょうか？市販品だったらデータシートに書いてあるはずです。考察するにあたってその情報は必要です。

バッファーと抗体の相性（バッファー置換により濃度低下） 削除/引用 No.11131-1 - 2023/01/20 (金) 15:53:12 - 抗体 バッファーによって濃度が半分以上低下する抗体があります。 白く濁るので、おそらく凝集しているのだと考えられます。 例えば、MESでは大丈夫でしたが、HEPESでは濃度が低下しました。 原因として何が考えられるでしょうか。 よろしくお願いいたします。

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