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好塩性酵素の発現 トピック削除
No.11127-TOPIC - 2023/01/18 (水) 23:44:30 - やさな、
好塩性酵素を大腸菌でつくらせて、それを塩存在下で透析することでリフォールディングしました。発現させた大腸菌は本来アミラーゼを作るはずがないのですが、何度やってもアミラーゼ活性が出てしまうため、大腸菌のみの画分も同様に透析することで、間違いなく目的の酵素であることを証明しようとしました。同じ時間、デンプンと反応させてルゴール液を滴下した結果、明らかな色の違いが見られたため、リフォールディングは成功していると考察したのですが、時間が経つにつれ大腸菌のみのコントロールの方もじわじわと色が抜けてきているように感じました。

これはコントロールとして成り立ちますか?

わかりづらくて申し訳ないです。

助けて欲しいのでわからないところは聞いてください
 
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No.11127-5 - 2023/01/21 (土) 07:53:20 - おお
https://academic.oup.com/femsle/article/171/2/73/529311

文献を読まれるかどうかわかりませんが、大腸菌にはグリコーゲンを分解してリン酸化するglycogen phosphorylaseという酵素があるようで、基質はグリコーゲンなんですが、アミロースを基質にして酵素反応を行うとグリコーゲンのときの活性の十分の一ほどだけど活性が見られています。多分この酵素が一つの原因かと思いますが、その活性をベースラインとして差し引きでどれくらい活性が見られたという理屈は受け入れられと思います。

それでそういう弱い活性があったとき何が起きているのかDiscussionのレベルである程度うなずける事を推察していくことも科学的議論で重要なことでもあります。

(無題) 削除/引用
No.11127-4 - 2023/01/20 (金) 20:11:45 - おお
だいちょうの糖鎖を切る酵素
ー> 大腸菌の糖鎖を切る酵素

(無題) 削除/引用
No.11127-3 - 2023/01/20 (金) 20:10:39 - おお
示された状況だけで判断するとコントロールになると思います。大腸菌の成分がヨウ素を還元したりすれば、色か消失するだろうし、だいちょうの糖鎖を切る酵素があまり生理的には意味をなさいが非特異的と言えるレベルで消化しているかも知れません。そう言ったバックグラウンドとなる要因を差し引いて活性を見るのは生化学的な常套手段です。

(無題) 削除/引用
No.11127-2 - 2023/01/19 (木) 17:36:33 - toto
それは大腸菌と培地からの持ち込みによって起きてるとしか思えないので、それをバックグランドというか、コントロールにすればいいのではないでしょうか。

好塩性酵素の発現 削除/引用
No.11127-1 - 2023/01/18 (水) 23:44:30 - やさな、
好塩性酵素を大腸菌でつくらせて、それを塩存在下で透析することでリフォールディングしました。発現させた大腸菌は本来アミラーゼを作るはずがないのですが、何度やってもアミラーゼ活性が出てしまうため、大腸菌のみの画分も同様に透析することで、間違いなく目的の酵素であることを証明しようとしました。同じ時間、デンプンと反応させてルゴール液を滴下した結果、明らかな色の違いが見られたため、リフォールディングは成功していると考察したのですが、時間が経つにつれ大腸菌のみのコントロールの方もじわじわと色が抜けてきているように感じました。

これはコントロールとして成り立ちますか?

わかりづらくて申し訳ないです。

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