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(無題) 削除/引用 No.11125-10 - 2023/01/21 (土) 14:47:01 - WInter-8 補欠分子の不足や翻訳後修飾に問題はないでしょうか。 あるいは、Hisタグが付与されたことによる阻害（N末端あるいはC末端が活性に重要で、Hisタグによって不活性化されている）も考えられます。

(無題) 削除/引用 No.11125-9 - 2023/01/20 (金) 19:53:58 - おお 因みにに精製したタンパクにシャペロニンが結合して離れてない事もよくあるようで、カラムに乗せwash した後、あるいはwash 後にATPを含むWASH バッファーを流してシャペロニンを外してから溶出すると言った方法もあるようですが、外した時に構造が矯正されることが期待できるかは、明言できません。ありえるかなとうい妄想の範囲です。

(無題) 削除/引用 No.11125-8 - 2023/01/20 (金) 19:46:44 - おお 低温で、翻訳効率などを下げ翻訳と同時進行のフォールディングを助けると言う手法もあります。IPTGの濃度を下げるのもその助けになるかも知れません。詳しく覚えていませんが、ラクトースを使ったり、グルコースとのコンビネーションとかで徐々に発現させると言ったようなやり方もあった気がします。 また、シャペロニンを強制発現させた菌株とかあった様に思いますが、詳細は覚えていません。そう言う菌株を使わずにヒートショックで誘導すると言ったやり方もあったと思います。 誘導時間が長いのも気になりますね。1、2時間で結構ちゃんと発現してたりもしますし。

(無題) 削除/引用 No.11125-7 - 2023/01/20 (金) 18:15:38 - T >G25さん SDS-PAGEによる確認はアフィニティ精製後です。 精製前の活性は超音波破砕後の上清でみました。 大腸菌のクローンは自分で新たに作製したものです。

(無題) 削除/引用 No.11125-6 - 2023/01/20 (金) 14:37:10 - G25 SDS-PAGEによる発現の確認といのは 1)菌体全部、whole lysate 2) lysateの上清、または沈殿物 3) アフィニティー精製後 どれを見ているかもちろん、アフィニティー精製後の塩基泳動やタンパク質定量はしてると思うけど。 また、粗抽出物の活性をチェックしたのは(1)、(2)どっちだろう。 私の懸念は、発現したタンパク質が封入体に行って不溶化してたりするのかな、ということ。それならIPTG濃度を下げることで軽減できる可能性はあるけりそうだけど。 先輩がやってたときはうまく行っていたわけですね。 そのときと同じ大腸菌のクローンですか？タンパク質発現用の形質転換体はストックすると性質が変りがちといいますし。 ひょっとすると形質転換し直すと良くなるかもしれませんね。同時に宿主を変えてみるとか（フォールディングに強いというOrigamiとかRosettaとかTunerとか）。

(無題) 削除/引用 No.11125-5 - 2023/01/20 (金) 12:35:39 - T >G25さん 精製前でも活性はありません。 先輩と同じ酵素を扱っていて同じ方法をトレースして行っているのですがうまくいっていない状況です。

(無題) 削除/引用 No.11125-4 - 2023/01/20 (金) 12:33:59 - T >おおさん ありがとうございます。 DTT入れてみてやってみます。 精製前でも活性は無かったです。

(無題) 削除/引用 No.11125-3 - 2023/01/19 (木) 13:30:42 - G25 精製前の粗抽出液には活性あるのかな？ 最初から活性無いのか、精製の過程で失活しているのか、切り分けてから対策したほうがいいんじゃないかな。

(無題) 削除/引用 No.11125-2 - 2023/01/19 (木) 11:17:26 - おお 簡単にこうしたらいいという決まったやり方とかはないですね。 精製後DTTを加えてみるとかだけでも可能性ありますし、あるタンパクはアルギニンや場合によってはヒスチジンの存在化では安定しているという話もありますし。あるタンパクはニッケルカラムのあとヒスチジンで透析すると活性が落ちて、透析前の溶出フラクションでは活性があったという文献の記述を見たことがあります。 コファクターも気になるところですが、Znフィンガーを持っているタンパクなら培地にZnイオンを入れておけばいいという話も聞きます。また修飾などが必要なら大腸菌ではできないものであれば考えないといけないことも出てくるでしょう。 デタージェントがあまり良くない場合もあるでしょうけど、逆もあると思いますし。 大腸菌からのLysateで直接活性が測れるなら色々な条件で活性を見ていくこともありかもしれませんね。また活性があって精製後活性が失われるなら精製のときの工夫をやればいいことになりますしよりシンプルです。

IPTG誘導によって過剰発現したタンパク質の失活 削除/引用 No.11125-1 - 2023/01/18 (水) 21:33:53 - T 酵素遺伝子をpET-24aに導入し、BL21(DE3)でIPTG誘導による過剰発現発現を行っています。 IPTG濃度は0.4mMで室温12時間で誘導を行っています。 Hisタグ精製の後に酵素活性を測っているのですが活性が無い状態です。 SDS-PAGE上には目的タンパク質が過剰発現しているのが確認出来ているのですがなぜ失活しているのかが分からない状態です。 IPTG濃度を下げればミスフォールディングを防げるのでしょうか？

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