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(無題) 削除/引用 No.11123-7 - 2023/01/22 (日) 02:25:16 - おお >一次抗体がヒト血清　25度オーバーナイト これって、血清をそのまま使ってますか？ 2xブロッキングバッファーを等量加えて一次抗体反応液にしてもいいかもしれません。ブロッキング剤もスキムミルク以外に色々選択肢があるので変えてみてもいいでしょう。個人的にはPVPをおすすめします。 また、オーバーナイトはありえるプロトコルですが、1時間もあれば十分なことが多いです。

(無題) 削除/引用 No.11123-6 - 2023/01/22 (日) 00:51:57 - あお AP標識を使っているのは単純に発色が楽だからですね。 先述のように9枚ずつ同時に作業できるので、すごく楽です。 また、発色まで同じ箱の中で完結するので、取り違えもなく安全です。 実際に論文に載せるときはHRP標識を使おうかなという気持ちはあります。

(無題) 削除/引用 No.11123-5 - 2023/01/21 (土) 21:19:04 - v 2ml でオーバーナイトで振ってるならば、パラフィルムとラップで密閉しといたほうがいいです。2mlはこの容器だと必要ギリギリの液量と思うので蒸発して液量減ればそれ以下になります。メンブレンが浮き上がってムラになるのは液量不足だからと思われます。全ての工程で液量を２〜３倍に増量することも検討ください。 シールしてインキュベートする方法ならばこの問題は起きません。 western blottingの初期の頃に使われていたAPの発色法であえて検出されているのは何か特別な理由があるのですか。発色法は感度の面で、現在主流の化学発光法などと比較して劣ります。そのため抗体の量やサンプル量も増やさないといけないので、その面でのトラブルもあると思われます。

(無題) 削除/引用 No.11123-4 - 2023/01/19 (木) 17:52:12 - あお メンブレンは横5ミリに切っています。 縦は通常サイズだと思ってください。1センチから1.5センチくらい切ることもあります。 インキュベートする際は横1センチ、縦6-8センチくらいの仕切り（今手元になくて曖昧です）で、一度に9枚同時に作業できるような容器を数個使っています。仕切られた区画あたりに基本2ml入れています。 シーラー使うような方法も知ってはいますが、作業効率の面でこちらの容器を使う方法を利用しています。 今思うと、抗体反応の際はシーリングしてウォッシュだけこの箱でやってもそこまて作業効率変わらない気もしてきました。。 ブロットされたタンパク質がメンブレンを「ブロッキング」していて、ブロットされていない素のメンブレンをブロック剤でブロックするよりバックグラウンドが低くなっているんですね。 →これは説得力のありそうな意見に思えます。 シグナル陽性のメンブレンはバンド強度が適当なところで反応停止するけど、陰性のメンブレンは用心のため反応時間を長く引っ張ったりいませんか？ →上記の作業環境的に陽性と思わしきサンプルと陰性と思わしきのサンプルで同時に発色停止することになるのですが、その際にも逆転現象は起こっています。 感度がそれほど良くない系なので反応させ過ぎというのはあるのかもしれません。 上から抗体溶液チップ等で滴下して、上からそっとパラフィルムをのせて(ohp フィルムみたいなものでもいいと思う)乾燥を防ぐもある。 →この方法をもうちょっと詳しく教えていただきたいです。

(無題) 削除/引用 No.11123-3 - 2023/01/18 (水) 15:04:31 - おお ハイブリダイゼーションバッグというのがあり(実質的にはちょっと分厚いプラスティックフィルムを重ねてシーラーで密閉する方法)、短冊状に切ったものであれば500u l ぐらいで密閉した環境がつくれる。あるいいは、小さめのプラスティック容器にメンブレンを置き、上から抗体溶液チップ等で滴下して、上からそっとパラフィルムをのせて(ohp フィルムみたいなものでもいいと思う)乾燥を防ぐもある。 >恐らくネガティブの反応として、紫のバックグラウンドに薄いピンク おそらくブロッキングが適切でないため、いたるところに、AP標識抗体がついていて、タンパクが流れている部分はトランスファされたタンパクがブロッキング効果を発揮している状態だと思う。バックグラウンドがピンクと言っても検出が上手くいっていれば発色はそんなに目立たないはず。勿論必要な検出感度にもよるけど。血清でバックグラウンドが高い場合、なんらかのノンスペの吸収をした方がいいかも知れない。 https://www.enzolifesciences.com/science-center/technotes/2019/april/how-do-you-choose-the-right-western-blot-detection-method?/

(無題) 削除/引用 No.11123-2 - 2023/01/18 (水) 15:02:44 - G25 >実験の都合上縦に細切りにしたメンブレンを使っています。 どれくらいのサイズのストリップですか。 それをどのような容器でどれくらいの液量でインキュベートしているのでしょうか。 実験の都合上縦に細切りにしたメンブレンを使っています。 >�B色の逆転現象？ 通常ポジティブの反応ならピンクのバックグラウンドに紫のバンドが出ると思いますが、 恐らくネガティブの反応として、紫のバックグラウンドに薄いピンクのバンドが出る時が度々あります。 ブロットされたタンパク質がメンブレンを「ブロッキング」していて、ブロットされていない素のメンブレンをブロック剤でブロックするよりバックグラウンドが低くなっているんですね。バックグラウンドが発色してくるほど長時間の反応をさけるのがいいと思いますけど。ストリップはシグナルが出ようと出まいと同じ反応時間ですか？シグナル陽性のメンブレンはバンド強度が適当なところで反応停止するけど、陰性のメンブレンは用心のため反応時間を長く引っ張ったりいませんか？ ブロットを乾燥させブロッキングなしでやる迅速法なら、原理的にタンパク質乗っていない部分には抗体や基質が吸着しませんので、そのような「ネガティブ染色」はおこらないはず。 https://www.merckmillipore.com/JP/ja/life-science-research/protein-detection-quantification/western-blotting/protocols/q9ib.qB.710AAAFBRP0RRkww,nav

ウェスタンブロットのテクニック 削除/引用 No.11123-1 - 2023/01/18 (水) 13:54:35 - あお ウェスタンブロットのテクニック面で２.3点問題点があり、いい解決法があれば教えていただきたいです。 �@メンブレンがシェーキング中に丸まっていく現象を解決したい 実験の都合上縦に細切りにしたメンブレンを使っています。 オーバーナイトでインキュベートする手順もあり、最初は十分なバッファー量があるはずなのですが、 だんだん端っこもしくは真ん中からから浮いてきてしまいます。 最終的には�Aの発色ムラの原因になっている気がします。 血清を使ってることもあってあまり大量にバッファー量を増やしたくないです。 �Aアルカリホスファターゼ BCIP-NBT系での発色ムラ。 上記の乾燥もあるのですか、発色ムラが気になります。 メンブレンを直接染めるのである程度しょうがないのでしょうか。 �B色の逆転現象？ 通常ポジティブの反応ならピンクのバックグラウンドに紫のバンドが出ると思いますが、 恐らくネガティブの反応として、紫のバックグラウンドに薄いピンクのバンドが出る時が度々あります。 タンパク質量を多めにロードしているのでそれが原因でしょうか。 思い当たる原因や解決法はございますでしょうか。 TBST系でバッファーを作製しています。 ブロッキングは5%スキムミルクin TBST　25度　1時間 ウォッシュは各段階でTBST 5 min x 3回　TBSTで行っています。 一次抗体がヒト血清　25度オーバーナイト 2次交代が抗ヒトIgG AP標識　37度2時間 というようなプロトコルです。

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