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(無題) 削除/引用 No.11111-8 - 2023/01/18 (水) 01:56:19 - おお >[Re:7] おおさんは書きました : > >[Re:5] IPさんは書きました : > > > 1 lane当たり抗体1 ugです。Co-IP後、beadsに対して20 ulのSDS sample bufferで溶出します。 > > それならターゲットのタンパクは多分1ugより少ないだろうし、結合しているタンパクはそれよりも少ないと思います。 > > 補足しておきます。ターゲットが多数の分子の重合体であったりすると状況は違うかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.11111-7 - 2023/01/16 (月) 21:25:34 - おお >[Re:5] IPさんは書きました : > 1 lane当たり抗体1 ugです。Co-IP後、beadsに対して20 ulのSDS sample bufferで溶出します。 それならターゲットのタンパクは多分1ugより少ないだろうし、結合しているタンパクはそれよりも少ないと思います。

(無題) 削除/引用 No.11111-6 - 2023/01/16 (月) 17:03:09 - 774R 一つの推理ですが、糖鎖修飾を受けたタンパク質が優先的に複合体を形成してる可能性が挙げられます。 トータルで見たときには修飾を受けた物の割合がすくなく、lysateのレーンではバンドが識別できなくても、IPで濃縮されたという可能性です。 その場合、スメアーのバンドがlysateのバンドよりも高分子側にシフトしるはずですが、どうでしょうか？ あるいは、単にアグリゲーションか分解の可能性もあります。

(無題) 削除/引用 No.11111-5 - 2023/01/16 (月) 16:23:11 - IP >[Re:3] おおさんは書きました : > タンパクが多くて泳動が乱れるのはマイクログラムオーダーで、標準的なco-IP でそんなに多いタンパクが回収できているであろうか。 1 lane当たり抗体1 ugです。Co-IP後、beadsに対して20 ulのSDS sample bufferで溶出します。

(無題) 削除/引用 No.11111-4 - 2023/01/16 (月) 15:46:36 - IP >[Re:2] 1さんは書きました : > コントロールとなるnormal IgG-beadsによるIPの方はシグナル（ほとんど）なしという理解でOKですか。 beadsとanti-FLAG AbとFLAG fusion proteinをtransfectionした細胞のlysateを入れたもののみスメアが見られ、beadsと抗体と空ベクターをtransfectionした細胞のlysateでは見られません。 > 抗体はどのようにビーズと結合されているでしょうか？　1)ビーズに共有結合で直接、架橋、OR 2)protein A/G-beadsに共有結合で架橋、OR 3)protein A/G-beadsに結合（化学的架橋はなし）。 深く調べていませんでしたが、Dynabeads Protein Gとmouse IgG2b anti-FLAGです。調べたら結合は弱いそうです。 > 溶出方法は？ > 1) 低pH buffer, OR 2)SDSなどの変性剤を含むbuffer(還元剤あり。OR ３）SDSなどの変性剤を含むbuffer(還元剤なし）OR 4)その他の方法 pH6.8, SDS, 2-MEが入ったbufferです。 > whole cell lysateでwestern blottingしてもスメアなパタンになりますか？ cell lysateではスメアになりません。 > 研究対象のタンパク質は翻訳後修飾を受けることが知られていますか。 糖鎖修飾を受けます。 > 研究対象のタンパク質は膜タンパク質ですか。 膜タンパク質です。 説明不足で大変申し訳ありませんでした。

(無題) 削除/引用 No.11111-3 - 2023/01/14 (土) 00:29:21 - おお タンパクが多くて泳動が乱れるのはマイクログラムオーダーで、標準的なco-IP でそんなに多いタンパクが回収できているであろうか。 IPフラクションに修飾されたタンパクが目立つ場合はすめあに見える場合もあると思う。糖修飾や複数箇所のリン酸化部位。糖修飾は細胞質や核タンパクでも起こる。ユビキチンかしたタンパクに相互作用するなら、レーンの広範囲でスメアに見えることもある(うまくラダー状に見える場合もあるだろうけど) IPの時の生理的なのかアーティファクトなのかわからないけどタンパク自身のトランケーションが起こっている可能性もあるだろう。 オーバーロードでなくともシグナルが非常に強くなると、シグナルが上下に広がる事はある。大抵は露光時間や抗体の量でコントロールできそうなものだけど、そう言う場合はシグナルが横にも広がるので、邪魔になることもあるかも知れない。ロードする量を減らしてもいいだろうが、同時にやっていて弱いシグナルのフラクションがあるなら、それが検出できないか、検出できるまで露光時間を伸ばすと、結局は同じようなイメージになってしまうかも知れない。

(無題) 削除/引用 No.11111-2 - 2023/01/13 (金) 18:15:15 - 1 コントロールとなるnormal IgG-beadsによるIPの方はシグナル（ほとんど）なしという理解でOKですか。 抗体はどのようにビーズと結合されているでしょうか？　1)ビーズに共有結合で直接、架橋、OR 2)protein A/G-beadsに共有結合で架橋、OR 3)protein A/G-beadsに結合（化学的架橋はなし）。 溶出方法は？ 1) 低pH buffer, OR 2)SDSなどの変性剤を含むbuffer(還元剤あり。OR ３）SDSなどの変性剤を含むbuffer(還元剤なし）OR 4)その他の方法 whole cell lysateでwestern blottingしてもスメアなパタンになりますか？ 研究対象のタンパク質は翻訳後修飾を受けることが知られていますか。 研究対象のタンパク質は膜タンパク質ですか。

Co-IP-Western blot解析　スメアになる 削除/引用 No.11111-1 - 2023/01/13 (金) 16:24:49 - IP いつも参考にさせて頂いています。よろしくお願いいたします。 結合を解析したいタンパク質を強制発現させた細胞のlysateを用いて、Co-IPの後にウェスタンブロット解析を行っています。 IPサンプルでのみスメアが起こるのですが、これはタンパク量が多すぎるためでしょうか？ 解決するには溶出バッファーなどを増やすなどの処置をすればよいでしょうか？

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