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(無題) 削除/引用 No.11101-6 - 2023/01/10 (火) 10:10:25 - momo SRalphaプロモーター（SV40-HTLV1）もlymphoid系細胞に強い印象があります。 https://www.addgene.org/vector-database/1923/ https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC363152/

(無題) 削除/引用 No.11101-5 - 2023/01/10 (火) 04:59:43 - おお あとはどの細胞を使うべきかと言うのは、考えている細胞に近いほうが理想的です。しかしながらそれで実験系が組めるかどうかは別の話です。そういう意味で違うタイプの細胞を使うのは有り得る話です。デメリットとメリットの兼ね合いになるでしょう。また調べれば色々なデーターがあると思いますから、タンパク、RNA発現プロファイルなどからその遺伝子の役割に重要なタンパクが発現しているかとか、その遺伝子の過剰発現で既知のその遺伝子の効果が出るかなど色々と調べてみてもいいかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.11101-4 - 2023/01/10 (火) 03:12:49 - おお Transformationの効率なのか、白血球ではネガティブなレギュレーションが他の細胞よりも強く働いているのか、それを確認するためのGFPなどでいいから導入してみてもいいかもしれませんね。 もしかしたらDomain dissectionなどをやって安定性に関わる場所を特定してそこをいじるというやり方もあり得るのかもしれません。 また、白血病細胞であまり発現してないとか、よく発現しているとかどのように決めているのでしょうか？Endoとの比較でそれなりに強ければもしかしたらそれでいいのかもしれません。あるいはそのWTの発現で期待できる既知のOUTPUTがありますか？それが動けばそのレベルの発現で生理的な意味があると判断できると思います。 色々な方が発現が強い、弱いというのですが（自戒という意味を含めて）、これって冷静に見ると基準が分からなく（あるいは基準が正しいのか分からなく）戸惑ってしまうことがありますね。一般的には血球系ではEF1のほうがCMVよりも効率がいいと言われていたとおもいます。 白血病ウイルスのプロモーターとか使われてないのかなと思って調べてみると、EF1a-HTLVのハイブリットはあるようですね。 addgene.org：135612、EF1α-eGFP-Z1 https://www.invivogen.com/pselect-puro

(無題) 削除/引用 No.11101-3 - 2023/01/09 (月) 19:36:20 - 1 細胞自体の生物学的特性かもしれませんが、一方で、どのホストでも同様の傾向があるならば単に導入効率の違いを反映した結果かもしれないですね。白血病細胞を対象とした研究なので、接着系細胞だと、なんで浮遊系使わないの？浮遊系ではどうなの？とかレビュアーに聞かれるかもしれないですね。私は接着系しかやったことないですが、浮遊系の方が高効率の導入は結構難しいと聞いているので、トランジエント発現系だと色々難しいかもしれないですね。 なのでここは多少時間かけてでもここは浮遊系細胞で安定発現株を作るのが長期的な視点で見たら堅実な方法ではないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.11101-2 - 2023/01/09 (月) 02:16:46 - み 浮遊細胞では導入効率が低いだけじゃないですか。 そもそも着目している遺伝子が内在性で高発現している細胞をホストにした方が良いでしょう。 白血病関連遺伝子なら白血球での機能を検討するのが筋かと。 今後、ノックダウンした時の影響とか見る可能性があるならホストの選択は慎重にされた方が良い。 僕なら白血球系で安定発現株作るかゲノム編集で変異導入するかな。

浮遊性細胞を使うべきか、接着細胞を使うべきか。 削除/引用 No.11101-1 - 2023/01/08 (日) 19:52:36 - Hum 比較的稀な白血病の遺伝子変異の機能解析を行う予定です。 試しに、この遺伝子変異をCMV promoterとEF promoterの元発現させたところ、白血病由来（この稀な白血病のcell lineはないので、他のものをつかっています）の浮遊性細胞では発現量が弱く、接着細胞では、強い発現が得られました。 いずれのプロモーターでも、どの細胞種を使ってもほぼ同じ傾向が見られます。 RNA-seqやWBでの発現解析を開始しようと思うのですが、接着細胞で解析した方が、タンパク質の影響を見やすい気もしますが、この考えは間違いでしょうか。 発現量が少なくても、浮遊性細胞を使った方が、いいのでしょうか。

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