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(無題) 削除/引用 No.11100-13 - 2023/01/11 (水) 15:48:12 - nn 濃度を薄くしてみて実験しましたが、（Vectorが10 ng~0.01 ng）濃いほうがライゲーション効率は良いという結果でした。 ただ、反応条件を１６℃にすることで環状産物を多く得ることができました。 正直なぜこれでうまく言ったのかはわかりませんが、DNAを精製し直して改善したのでそこがクリティカルだったのかもしれません。 勉強になりました。ありがとうございました。 なれておらず解決のチェックが付けられないのですが、解決ということで宜しくおねがいします。

(無題) 削除/引用 No.11100-12 - 2023/01/10 (火) 12:13:32 - G25 ゲノムライブラリーを作ろうとしている生物のゲノムサイズがどのくらいで、どのくらいのcoverageのライブラリーを目指しているのかがわからないので、 ただの老婆心になるかもしれませんが、 例えば、マウスくらいのゲノムサイズで、平均インサートサイズ20 kbのライブラリを作るとき、ゲノム上のどの配列に対しても最低１個のクローンが99.9%の確率で得られるようにするには10^6程度の独立したクローンからなるライブラリにする必要があります。 λファージベクターだと無理では無いんですが、プラスミドだとインサートサイズも組換えクローン数もそんなに大きくするのは困難です（もちろんインサートサイズが下がれば必要クローン数は増えます）。 また、λファージだとno insertやインサートが重合したキメラはパッケージングされるサイズに合わないので生えてこないので、バックグラウンド低いですけど、プラスミドだとそういうのも生えてきますから、だいぶ歩留まりが下がります。先のコメントでもちょっとふれたように、そうならないようにするトリックも無いわけではないですが。 ゲノムサイズが小さい原核生物であるとか、網羅的なライブラリーでなく部分的なものでいいとか、条件があってのことかもしれませんけど。

(無題) 削除/引用 No.11100-11 - 2023/01/10 (火) 02:41:56 - おお >[Re:7] G25さんは書きました : > > 読み返せばプラスミドは脱リン酸化するわけでプラスミドのダイマーをー見ている理由がよくわかりませんが。 > > ほんちゃんはそうだけど、予備実験としてone cutしたプラスミドを脱リン酸なしにligation して効率を評価しようとしている、と書かれてます。 そうなんですが、そうだとすればライゲーションの効率を見積もるにおいてダイマーなど含めてしまってもいいのではないかと。それとも自己閉環よりもダイマーとかを実際の効率としたほうがいいのか、、、それも変ですよね。 >[Re:1] nnさんは書きました : >Vector 60 ngをT4ligase 100 U（NEB)、反応用量は5 ulで 確かに他にも指摘があるように反応系の容量が少ない様に思いますね。 具体的に覚えてませんが、ライブラリーなら特に２０ｕlぐらいの容量ぐらいが平均的なやり方何じゃないかと。また６０ngというのも妥当かどうかわかりませんもうすこし少ないのではとも思います。 トランスッフーメーションも大腸菌一つに一つのプラスミドが入るくらいの量にするように意識しないと、一つの大腸菌に２種類入ったりすると、プラスミドのReplicationに不利なものが淘汰されるのでライブラリーのバイアスが大きくなります。そういう意味でも６０ngに対して結構の量のコンピテントがいるのではと勘ぐってしまいます。 この手のことが盛んにされる用になったのは１９９０から２０００年あたりだと思いますが、その頃の標準的プロトコールを一度確認されてみたほうがいいのではないでしょうか。 また、インサートの量比は振って一番いい効率のものを使うというプロトコールをよく見かけていたように思います。

(無題) 削除/引用 No.11100-10 - 2023/01/09 (月) 17:39:42 - G25 ライゲーション反応でDNA濃度を下げるということで言えば、PEGなどの促進剤が入っていない反応バッファを使った方が理にかなっています。PEG等はmolecular crowding agentでDNAの濃度を実質的に高めることでライゲーション効率を上げているわけですから。市販のライゲースに添付されているバッファはほとんどPEG入りです。ライゲーションバッファはATPとTris bufferさえあれば自作できます。 > とりあえずDNAの濃度を下げることはやってみます。ただ、ライブラリづくりには意味ないような… そのとおり、まさに、ライブラリのライゲーション効率を上げようというのに、マルチマーを減らして自己環状化モノマーを増やす条件検討をするというのが意味ないような、、、

(無題) 削除/引用 No.11100-9 - 2023/01/08 (日) 23:51:07 - G25 > Vector 60 ngをT4ligase 100 U（NEB)、反応用量は5 ulで めちゃくちゃ濃くないですか？ 重合より自己環状化を優位にするならその1/10以下の濃度でいい。 もしもライブラリの規模の関係で大量のベクターを投入したいならライゲーション反応のスケールアップをして濃度を低く抑える。私は、ちょっと違う実験(プラスミドレスキューやinverse PCR)でしたが、比較的大量のDNAを自己環状化するのに、500 uLくらいのスケールでライゲーションすることもありました。 > SCの位置にバンドがでてるのですがコレは何でしょうか… これわかったかも。 EtBrなどインターカレータイ存在化で泳動していますね。 lagation産物がニックのない環状だと、そのままではrelaxed circularだけど、インターカレートによって巻きが強まってscになるらしい(Molecular Cloningで読んだことあったっけ)。インターカレータ依存的なsc。私、後染め派なので経験したことなかった。 scの程度はインターカレーターの濃度依存的だったはずで、大腸菌から精製したscと移動度が全く同じとは限らないですが、たまたま見分けがつかないほど近かったのでしょう。 自宅からだとアブストしか読めなかったけど、これがヒントになりました。 https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0003269718303816

(無題) 削除/引用 No.11100-8 - 2023/01/08 (日) 20:46:33 - nn > dimerの産物を減らしてライゲーション効率を50％ほどにあげたいのですがどうしたら良いでしょうか。 > この数字は何を元にしているのでしょうか？興味があります。出典とかあります？基本プロトコルでうまくいってて、それが10から20％という事ですよね。高い効率を目指せばより良いこともあるのだろうけど 教員の方から経験則的に普通50％くらい進むよねということでした。ただライゲーション効率を上げることで精製すべきゲノムの量などを大幅に減らせます。 > Ligationでsupercoiled(sc)にはなりません。 SCの位置にバンドがでてるのですがコレは何でしょうか… Ligation mixをcutする前のプラスミドと一緒に泳動するとプラスミドのSCの位置にLigase依存的にバンドが出現します。 またゲノムライブラリについても言及助かります。しかしながら行う系の関係でプラスミドで行うしか無いです…

(無題) 削除/引用 No.11100-7 - 2023/01/08 (日) 20:12:07 - G25 > 読み返せばプラスミドは脱リン酸化するわけでプラスミドのダイマーをー見ている理由がよくわかりませんが。 ほんちゃんはそうだけど、予備実験としてone cutしたプラスミドを脱リン酸なしにligation して効率を評価しようとしている、と書かれてます。

(無題) 削除/引用 No.11100-6 - 2023/01/08 (日) 19:28:17 - おお ゲノムのライブラリーはファージを使ったものがよく使われていました。ライブラリーの独立したクローン数字をプラスミドより稼げるのでゲノム配列をプラスミドよりカバーしやすいのが一つの理由だったはずです。読み返せばプラスミドは脱リン酸化するわけでプラスミドのダイマーをー見ている理由がよくわかりませんが。

(無題) 削除/引用 No.11100-5 - 2023/01/08 (日) 19:17:11 - G25 Ligationでsupercoiled(sc)にはなりません。 大腸菌の中でトポイソメラーゼがATPのエネルギーを使って巻き強めるからscができるので。 Ligationでできるとすれば(脱リン酸していなければnickはないにしても)、scしていない開環状だと思いますがだとしたら、linearとほぼおなじ、やや遅れた位置にくると思います。 ライブラリを作るのだったら、いじるところがちょっと違うかな。 たとえばインサートの方脱リン酸化して大過剰投入するとか。 セルフライゲーションを防ぎベクターとインサートのligation しか起こらないようにするトリックもいろいろあります(5‘突出末端のpartial fillingとか)。 あと、ゲノムDNAライブラリならプラスミドよりlambdaファージなんかの方がいいと思いますが、 材料によるのかな。少なくとも真核生物ゲノムならそうだな。それともBACクローンなんかのサブライブラリなのかしら。

(無題) 削除/引用 No.11100-4 - 2023/01/08 (日) 19:00:51 - おお >[Re:1] nnさんは書きました : > クローニングをしています。 > Insert+vector(脱リン酸化済み)＋Ligaseで反応させると得られるコロニーが少ないことからトラブルシューティングをしています。 特定のインサートを入れるコンストラクションでは一つでも目的のクローンが取れれば良いとmolecular cloning1st Edに書かれています。また個人の感想のレベルですが効率はインサートの配列などにも依存しているようにも感じてます。クローンの数よりもバックグラウンドの数を減らす事を考えた方がいいのではと思ってます。 > まずは脱リン酸化していないVectorを1cutしてライゲーションさせて形質転換し、ライゲーションがうまくできるかを検討しています。 > > dimerの産物を減らしてライゲーション効率を50％ほどにあげたいのですがどうしたら良いでしょうか。 この数字は何を元にしているのでしょうか？興味があります。出典とかあります？基本プロトコルでうまくいってて、それが10から20％という事ですよね。高い効率を目指せばより良いこともあるのだろうけど。 ただし効率を上げる方法はありそうです。インバースPCRってご存じですか？ゲノムなどを制限酵素で切って、そのフラグメントを環状化して既知の配列の周辺をPCRで増幅して配列を読む方法です。一分子のフラグメントから環状DNAを作るためにDNA濃度を下げてライゲーションします。既に指摘はあるようですが。ただカットしたプラスミドにインサートを入れる場合、インサートのの濃度との兼ね合いなど複雑になってくると思うし、同じようにインサートのの濃度を下げる場合両者が出会う確率も減るだろうから、反応時間を伸ばして対処できる範囲なのか。インサートのがセルフでライゲーションされないような非パリンドロームの配列で切り出せるような制限酵素使うなら、インサートのの濃度は多少高めでもいいかも知れない。

(無題) 削除/引用 No.11100-3 - 2023/01/08 (日) 18:40:54 - nn ありがとうございます 現在はライブラリ作成中でしてライゲーション効率をあげたいと思っているところです。そのためinsertはゲノムの切断産物を予定しています。 （現在、セルフラーゲ−ション率が10〜20％、insertとのライゲーション率が4％ほどです。） ＞そもそも電気泳動で環状化したライゲーション産物は区別つくんでしょうか。 どういう判定をしているのか興味あります。 Vectorが3 kbですのでLigase反応前よりも下に存在するバンドはSuper coilだろうと推定しています。一方、反応前よりも上の方にあるバンドはLiner-dimer、trimerの産物であろうと考えています。実際、6 kbの位置にはバンドが濃く見えています。このようなバンドが20 kbの位置くらいまで存在しています。 とりあえずDNAの濃度を下げることはやってみます。ただ、ライブラリづくりには意味ないような…

(無題) 削除/引用 No.11100-2 - 2023/01/08 (日) 18:14:38 - G25 そういうものです。どうしたって重合体ができるでしょ。環状化したライゲーション産物はほんの僅かしかないもので、それでも十分な形質転換体が得られるという実験デザインです。pg 程度できてれば数百cfuくらいになるはずですけど。それともライブラリーでも作るつもりで、効率がクリティカルな実験をしているのかしら？ そもそも電気泳動で環状化したライゲーション産物は区別つくんでしょうか。 どういう判定をしているのか興味あります。 重合より環状化を優位にするためには、 ・DNA濃度を下げる（濃度が高いと分子間のコリジョンが優位になって、分子内（末端同士）のライゲーションが起きにくくなる、とか）。 ・反応温度を下げる（14, 12, 4℃など） というのが教科書的だと思います。 ところでinsertはどうやって調製したものでしょうか。 以前もコメントした事があるのですが、PCR産物のプライマー上の配列を制限酵素で切断して付着末端にする方法は、思いの外、効率が悪いです。 PCRの条件も影響するようです(サイクル過剰とか）。

Ligationするとdimerができる 削除/引用 No.11100-1 - 2023/01/08 (日) 17:21:06 - nn クローニングをしています。 Insert+vector(脱リン酸化済み)＋Ligaseで反応させると得られるコロニーが少ないことからトラブルシューティングをしています。 まずは脱リン酸化していないVectorを1cutしてライゲーションさせて形質転換し、ライゲーションがうまくできるかを検討しています。 Vector（3 kb）は プラスミドをminiprepで精製 BamHIで切断 切り出し精製 により得ています 以上により得たVector 60 ngをT4ligase 100 U（NEB)、反応用量は5 ulで25℃10分反応させ、形質転換させると、ライゲーション効率が10〜20％ほどだと推定できました。 ライゲーション産物をゲルに流して確認すると環状になっているものとは別にVectorのバンドよりも大きい産物が確認できました。(おそらくliner dimerやtrimer) dimerの産物を減らしてライゲーション効率を50％ほどにあげたいのですがどうしたら良いでしょうか。

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