お世話になります。
現在、pLVX-Puroプラスミドに遺伝子のクローニング（２kb）を行っていますが、よくわからないことが起きており、皆様のご意見をお聞きしたいです。よろしくお願いします。
尚、当方、プラスミド構築は随分長く経験がありますが、このようなことは今回が初めてです。
２kb遺伝子は別のプラスミドよりKOD-Oneにて15サイクル後、ゲル抽出（UV照射なし）し、BamH1-HFとXba1で1時間切断後、キアゲンスピンカラムで精製しました。
一方、pLVX-PuroはStbl3大腸菌から調製したmidiprep産物で、1 ugを同様の酵素で切断し、その後ゲル抽出、さらにはquick CIPで15分37度処理後（実際には必須はないのですが）、キアゲンスピンカラムで精製しました。
vectorを1 ul (= 50 ng相当)と、PCR産物5 ulを混ぜ、そこへHiFi T4 DNA ligase 0.75 ul ＋H2Oでトータル10 ulで一晩4度でライゲーション後、Stbl3に形質転換しました。
翌朝、PCR産物なしのプレートから２コロニーが、PCR産物ありのプレートから4コロニーが出たため、cPCRにて予想されたサイズのバンドが出たコロニーをピックしました。
そのコロニーからmini cultureしたものをBamH1-HFとXba1で切断確認すると、2 kbのものが出てきませんでした。midiprepしても同様でした。
ただし、シングルカットはできているのか、未カットに比べてバンドの出方は異なり、さらにpLVX-Puroの分子量よりも2 kbほど高い位置にバンドがでましたことから、シングルカットはできているけど、ダブルカットはできていないのではないかと考えるようになりました。
このようなことはあり得るのでしょうか？
もしかしたらどちらかの制限酵素がワークしていない可能性はあるかもしれません。コロニー自体少なかったので。 |
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