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HEK293Tで、1細胞1プラスミドは可能か？ トピック削除
No.11089-TOPIC - 2023/01/02 (月) 08:20:59 - 安西光義
HEK293TにSV40repを持つプラスミドを導入すると、細胞内でプラスミドが複製されると聞きます。
その場合、薄いプラスミド濃度（1細胞に１プラスミドが入るか入らないかの濃度）でHEK293Tにエレポしても、細胞内でプラスミドが増幅するので、きちんと発現するのでしょうか。

具体的にはライブラリープラスミドを低濃度でHEK293Tにエレポし、異なるタンパク質をそれぞれの１細胞に発現させたいと考えています。大腸菌や酵母では可能ですが、HEK293Tでも可能なのでしょうか？
ウイルスベクターをMOI<1で使えばできるのですが、ウイルスベクターは使わずに達成したいです。

フナコシのEnhanced Episomal Vector (EEV)という製品の情報をみると、
HEK293Tに導入しても、日毎に発現が落ちているので無理なのかもしれん。

また、HEK293TではなくCHOもepisomal にプラスミドが複製されると聞いたことがあるのですが、こちらの系を使用されている方はおりますか。
基本的にHEK293Tと同じようなレベルでプラスミドが増幅するのかな。

どうぞよろしくお願いします。

安西光義
　
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(無題) 削除/引用
No.11089-5 - 2023/01/03 (火) 12:58:12 - おお
ちょっと確認させてください。
これはcDNAライブラリーからとかのスクリーニングを考えていらっしゃるのでしょうか？

(無題) 削除/引用
No.11089-4 - 2023/01/03 (火) 06:45:59 - おお
>[Re:1] 安西光義さんは書きました :

>
> また、HEK293TではなくCHOもepisomal にプラスミドが複製されると聞いたことがあるのですが、こちらの系を使用されている方はおりますか。
> 基本的にHEK293Tと同じようなレベルでプラスミドが増幅するのかな。

PMID: 1628626
PMID: 10859355
PMID: 19003202

上記はウイルスのOriginを利用してませんが、CHOでもSV40 T antigenに類似した系があるようです（下記文献）。しかしSV40ではありません。

PMID: 15948170

導入した遺伝子のコピー数に関してどれくらいかは調べてませんが、タンパクを産生するという観点では２９３Tに匹敵すると思います（場合によってはそれ以上かな）。

SV40 oriを利用した系ではHEK293TのほかにCOS cellsなどがあります。その亜株COS7はそういうのに特化したものとだったと思います。

(無題) 削除/引用
No.11089-3 - 2023/01/02 (月) 20:48:07 - 774R
２種類のプラスミドをトランスフェクションすると、たとえトータルの導入効率が低くてもプラスミド・トランスフェクション試薬複合体にに２種類のプラスミドが巻き込まれる確率が高いので、結果的に導入された細胞は導入効率の2乗よりも高い確率で２種類が入ってることになります。
２段階でトランスフェクションするほうがco-transfectionの可能性を減らせると思います。

(無題) 削除/引用
No.11089-2 - 2023/01/02 (月) 20:26:43 - おお
検証する手間を考えれば、個別に導入して混ぜた方が確実なのでは？

SV40、Tantigenの組み合わせは昔見たプロとコールの情報によると長期的な高発現の維持には向かず、72時間ぐらいから発現が減ってくるようです。

HEK293Tで、1細胞1プラスミドは可能か？ 削除/引用
No.11089-1 - 2023/01/02 (月) 08:20:59 - 安西光義
HEK293TにSV40repを持つプラスミドを導入すると、細胞内でプラスミドが複製されると聞きます。
その場合、薄いプラスミド濃度（1細胞に１プラスミドが入るか入らないかの濃度）でHEK293Tにエレポしても、細胞内でプラスミドが増幅するので、きちんと発現するのでしょうか。

具体的にはライブラリープラスミドを低濃度でHEK293Tにエレポし、異なるタンパク質をそれぞれの１細胞に発現させたいと考えています。大腸菌や酵母では可能ですが、HEK293Tでも可能なのでしょうか？
ウイルスベクターをMOI<1で使えばできるのですが、ウイルスベクターは使わずに達成したいです。

フナコシのEnhanced Episomal Vector (EEV)という製品の情報をみると、
HEK293Tに導入しても、日毎に発現が落ちているので無理なのかもしれん。

また、HEK293TではなくCHOもepisomal にプラスミドが複製されると聞いたことがあるのですが、こちらの系を使用されている方はおりますか。
基本的にHEK293Tと同じようなレベルでプラスミドが増幅するのかな。

どうぞよろしくお願いします。

安西光義
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