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(無題) 削除/引用 No.11076-4 - 2023/01/26 (木) 17:27:48 - Bcell emaさん、おおさん、 ご返信いただいていたのですね。申し訳ございません。 免疫マウスの血清を用いて、ウェスタンブロッティング、ELISA両方で確認し、目的タンパク質は検出できております。 ただ、B cellと蛍光抗原を混ぜてフローサイトメトリーを行うと、 全く結合しません。 ウェスタンブロッティング、ELISAは抗原がメンブレン、プレートに固定化されているので、くっつきやすいのかな、とも考えております。 ご指摘の通り、B cellと蛍光抗原をインキュベートしただけでは乖離しやすいのかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.11076-3 - 2023/01/06 (金) 15:06:54 - おお WBは変性したタンパクを検出しているので、B細胞を回収するための抗原はエピトープが露出してなかったり立体的構造のため抗体が認識していない可能性がないですか。

(無題) 削除/引用 No.11076-2 - 2023/01/05 (木) 14:07:30 - ema モノクロ抗体のHybridomaの作成などやりましたが、技術的には可能な手法です。 抗体はウエスタンで使えるものとFCMで使えるものは異なったりします。 「蛍光ラベルした抗原でB細胞を染色」の部分は希望のターゲットに関してできる分子構造なのでしょうか。（乖離しやすかったりなど色々な要因でここができない抗原もあります） 単に論文をなぞるではなく、他の手法ELISAでの確認など行っていますでしょうか。 MACSはポジティブセレクションで少なくなりすぎたり、MACSビーズと染色抗体が競合するような場合は他の分子の場合ですが �@T　CellなどでのMACS　ネガティブ　プロトコールにする �AB220-PEなどにして、anti-PEのMACSビーズにする などの工夫をしたことはあります。 また、ある抗原はつくってもつくってもIgGファミリーができず、IgMばかりで困ったこともあります。

マウス免疫後にFACSで抗原特異的B細胞を単離 削除/引用 No.11076-1 - 2022/12/28 (水) 09:37:10 - Bcell マウスを抗原で免疫した後に、抗原特異的なB細胞をFACSで単離することを試みています。 PMID: 27022949 の手法を忠実に再現し実施しています。 簡単に言いますとB細胞マーカー、蛍光ラベルした抗原でB細胞を染色し、 抗原に結合しているB細胞を単離するという手法です。 Fig.2, Fig.3等を見ますと、明確に抗原特異的なB細胞がいるようなのですが、 実際に実験をしてみると、このような抗原で染まるB細胞が全くいません。 血清中に抗原特異的な抗体が出ていることはウェスタンブロッティングで確認済みです。 論文のような抗原特異的なB細胞の染色および単離は、実際には結構難しいものなのでしょうか？ 詳しい方がおりましたらご教示頂けますと幸いです。

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