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(無題) 削除/引用 No.11071-7 - 2022/12/28 (水) 19:45:28 - IK > mp様ご回答ありがとうございます。 レンチを用いております。 puroで選択が本当にかかっているのであれば、やはり関係ないですよね.. おっしゃる通り、KOが致死的あるいは増殖に不利な可能性は考えられますね。 > おお様ご回答ありがとうございます。 それぞれのタイミングに関してvirus▶細胞接着後 　　　　　　　　　　　　　　puro▶播種時 で行おうと思います。 >KOされたものを拾うのは難しいでしょうけど、実験条件がちゃんとしていたな >ら、ヘテロは取れるはずで取れてないなら条件が改善の余地はまだあると言う >ことになります。 ヘテロも取れていない状況ですので、 >ほぼ全てがpure耐性になるくらいの状況で、少し高めのpuro で選択し、発現効>率が高いものを選択する を行いたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.11071-6 - 2022/12/27 (火) 13:01:35 - おお >[Re:1] IKさんは書きました : > ノックアウト細胞の作製で苦戦をしております。 > 手順の何か一つでも変えたいと思い、以下の二つを変えてみようと考えております。 > > 1. virus infectionのタイミング > 　普段は細胞播種後overnightでinfectionを行っているが、細胞播種と同時に行う。 ウイルスは細胞表面にある(トリプシンで消化されているかもしれない)タンパクと結合する事で感染するのではありませんか？浮遊細胞ならあり得る方法かもしれませんが。 > > 2. puromycin selectionのタイミング > 　普段はvirus mediumを除いて6時間以上回復培養 > 細胞を分割播種後overnightで選択を行っているが、分割播種と同時に行う。 これはどっちでも構わないと思います。導入が成り立ち、KOできた細胞がいればいつセレクションしても生き残るでしょうから。 そもそも、レンチではMOIで1以上で感染させるわけで3日とかで感染してない細胞が3 日ぐらいかけて死ぬような濃度ではセレクションも効かないはずです(理論上全部に感染してますから)。かなりの細胞が死んでしまうような状況なら、MOIが適切か一度検討してもいいはずです。AAVに関しては感覚はありませんが、ウイルスベクターの強みは感染効率だと思うのでほぼ同様ではないかと。 セレクションに関しては、まずMOIを上げて(レンチで1から10の間)ほぼ全てがpure耐性になるくらいの状況で、少し高めのpuro で選択し、発現効率が高いものを選択する方がいいと思ってます。 また、指摘があるようにKOで細胞が増殖しなくなるような遺伝子なら、KOされたものを拾うのは難しいでしょうけど、実験条件がちゃんとしていたなら、ヘテロは取れるはずで取れてないなら条件が改善の余地はまだあると言うことになります。 > > これらの方法で改善を見込めるものでしょうか。ご意見ください。 > また、何かアドバイス等ありましたら、よろしくお願いいたします。

(無題) 削除/引用 No.11071-5 - 2022/12/27 (火) 11:52:22 - mp レンチウイルスでしょうか？もしpuroで選択が本当にかかっているのであれば、感染のさせ方やpuro addのタイミングなどは関係がないと思う。経験上レンチでのKOの場合大抵９割くらいの細胞がKOされている印象。なのでBulkでの解析も可能なくらい。おそらく標的配列の問題か、あるいはKOが致死的あるいは増殖に不利で中途半端なクローンが得られているのでは？

(無題) 削除/引用 No.11071-3 - 2022/12/26 (月) 18:12:15 - IK Karas様　ご回答ありがとうございます。 言葉足らずで申し訳ございません。 苦戦の詳細としては、selection後に耐性遺伝子を発現するcloneは得られるものの、western blotting もしくは　genome sequence で確認してもノックアウトされていないといったところです。 Cas9の発現チェックを蛍光タンパク質で行うことはしていないのですが、Karas様のおっしゃる通りにピューロマイシン選択は3-5日程度で選抜が掛かる最低濃度を適用し、gRNAの配列の方も3か所ほど用いております。 今回質問させていただいた内容としては、virusまたはpuromycinを細胞に投入するタイミングは細胞播種と同時でいいのか？（その操作による違いは無いかもしれませんが）といった次第です。

(無題) 削除/引用 No.11071-2 - 2022/12/26 (月) 16:00:03 - Karas 苦戦の詳細が分からないので通り一遍のコメントになってしまいますが、 1. ピューロマイシンを使ってovernightでの選択ですが、期間が短すぎか濃度が濃すぎのように思います。ピューロマイシン選択は3-5日程度で選抜が掛かる最低濃度がお勧めです。1晩で選抜が掛かる濃度では陽性細胞のタンパク質レベルが変化することがあります。 2. Infectionのタイミングを変えることでCas9発現量は多少変化するかもしれませんが、実験の成否を左右する程ではないです。Cas9の発現チェックを蛍光タンパク質で確認しているのであれば、レンチウイルスなら3日、AAVなら5日あれば蛍光がはっきりと見えて来る筈なので、それを確認後にピューロマイシン選択を掛けるのが安心です。 3. gRNA配列によってはCas9/gRNAを強発現させて数日待っても2本鎖切断は起こらないことがあります。決め打ちして１つのgRNAだけを試されているのであれば、その配列の運が悪いだけという事もあります。

ノックアウト細胞の作製 削除/引用 No.11071-1 - 2022/12/26 (月) 14:27:50 - IK ノックアウト細胞の作製で苦戦をしております。 手順の何か一つでも変えたいと思い、以下の二つを変えてみようと考えております。 1. virus infectionのタイミング 　普段は細胞播種後overnightでinfectionを行っているが、細胞播種と同時に行う。 2. puromycin selectionのタイミング 　普段はvirus mediumを除いて6時間以上回復培養 > 細胞を分割播種後overnightで選択を行っているが、分割播種と同時に行う。 これらの方法で改善を見込めるものでしょうか。ご意見ください。 また、何かアドバイス等ありましたら、よろしくお願いいたします。

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