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(無題) 削除/引用 No.11066-10 - 2022/12/25 (日) 00:03:39 - 凄く初心者 皆様回答有難うございます。 ＞PC, NCは意味がないと言ってるわけではありません。もしそれが容易に可能ならば、あるいは抗体の特異性や活性に疑念があってその必要があるケースではしたほうがいいです。western blottingでは常にすべきか、またFigureとして出す必要があるかどうかということなら、その必要性がないならそこまでするほどのものではないでしょう、ということです。 分子量マーカーは必須です。これがないとなんでもあり状態になりますから。 私は長いこと内在性controlではなく総蛋白質染色で示してますが、それで　reviewerに何か言われたことは一度もないです。western blotting における総蛋白質染色の有用性については論文も出てるので文句言われたらそういうのを引用しとけば良いと思います。 ●このあたりのネガポジの感覚が分からなかったので非常に参考になりました。比較タンパク、分子量マーカーと総蛋白染色の組み合わせでやろうと思います。 ＞ただし、標準で割り算して補正するというのは信用できない。タンパク量とシグナル強度はリニアじゃないから。理想的には標準が一定になるようにロード量を調整した上で、標的の強度を直接比較する。ともかく標準ができる限り揃うようにすることがひつよう。 ●成程、勉強になります。あまりに標準強度が違う場合にはロード量を調整してなるべく近い値になるようにします。 ＞メンブレンの端というか縁に近い方が汚いのは、たぶんタッパーが小さめで揺らしてもメンブレンがあまり動いてないからと思う。メンブレンのサイズに対して大きめのタッパーで十分な液量入れて洗うとたぶん改善する。揺らしてる時にメンブレンがしっかり動いてることを確認されたい。 ●正にご指摘の通りでメンブレンと同じようなサイズのケースで洗浄しておりました。洗浄は大きいタッパーで十分行うようにしてみます。 初歩的な質問にも関わらず多くの方に回答頂き有難うございました。 出来る範囲で調べてやってみたものの細かい点で疑問点が出て困っておりましたが非常に勉強になりました。

(無題) 削除/引用 No.11066-9 - 2022/12/24 (土) 19:41:38 - 1 メンブレンの端というか縁に近い方が汚いのは、たぶんタッパーが小さめで揺らしてもメンブレンがあまり動いてないからと思う。メンブレンのサイズに対して大きめのタッパーで十分な液量入れて洗うとたぶん改善する。揺らしてる時にメンブレンがしっかり動いてることを確認されたい。 内在性コントロールにせよ総蛋白質にせよ、単に同じ量アプライできてますよと見せるというだけにとどまらず、ECLのシグナル強度を内在性コントロールのシグナル（ただし飽和していないという前提）なり総蛋白質染色の強度で割り算するのだから、理論上は、仮にアプライ量がばらついてても補正はできる。

(無題) 削除/引用 No.11066-8 - 2022/12/24 (土) 18:24:27 - G25 続き、 >３、コントロール関係は過去のトピックを見させてもらうと 　ポンソーs等の総蛋白染色が最も正確でeditarに文句を言われない 　ローディングコントロールは定量の正確性の問題があり、 　同一メンブレンのリブロッティングにこだわらず 　ブロッティングの正確性の問題はあるにせよ同一サンプルの 　別メンブレンのローディング比較でもよい。 　　という認識でよいか 言いたいのは、ロード量が一定であるということ。それが達成できるなら内部標準であろうと総タンパク質染色であろうと、同一ブロットだろうとレプリケートであろうと、どっちでも良い。 同一サンプルでレプリケート作った時に、乗っている量が違うようでは実験系が出来てない。 ただし、標準で割り算して補正するというのは信用できない。タンパク量とシグナル強度はリニアじゃないから。理想的には標準が一定になるようにロード量を調整した上で、標的の強度を直接比較する。ともかく標準ができる限り揃うようにすることがひつよう。 >４、イメージングの際にメンブレンの端の方がかなり強く発色してしまい、 　均一な画像が出にくい これは全く、主義の問題でしょう。 抗体や基質の当て方に変なムラが出ないようにすること。

(無題) 削除/引用 No.11066-7 - 2022/12/24 (土) 16:42:17 - 1 全てのwestern blottingのdataでpositive cont、negative contも示してる論文が実際のところどのくらいあるか、また投稿規定でそこまで要求しているジャーナルがどれほどあるか一度ゆっくり調べてみてください。（PC, NCは意味がないと言ってるわけではありません。もしそれが容易に可能ならば、あるいは抗体の特異性や活性に疑念があってその必要があるケースではしたほうがいいです。western blottingでは常にすべきか、またFigureとして出す必要があるかどうかということなら、その必要性がないならそこまでするほどのものではないでしょう、ということです。） 分子量マーカーは必須です。これがないとなんでもあり状態になりますから。 私は長いこと内在性controlではなく総蛋白質染色で示してますが、それでreviewerに何か言われたことは一度もないです。western blotting における総蛋白質染色の有用性については論文も出てるので文句言われたらそういうのを引用しとけば良いと思います。

(無題) 削除/引用 No.11066-6 - 2022/12/24 (土) 11:18:48 - 小ロロナ なみにその「担保する」は誤用だと思います。

(無題) 削除/引用 No.11066-5 - 2022/12/24 (土) 10:42:07 - 凄く初心者 皆様、返信有難うございます。 １、ポジコンについて同一分子量bandが同一蛋白の担保にならないというの 　確かにその通りで勉強になります。 ２、ネガコンも厳密にはKOの同一組織で特異性を確認する目的に使う ３.４、検体定量の泳動は同一メンブレンで行い、コントロールは別メンブレン　 　で問題ないが、総蛋白染色がやはりベター ウエスタンで調べるとポジネガの準備が必ず書いてありますが、抗体毎にコストが凄くかかり、おっしゃるように現実的ではないと感じた為実際どうしているのか疑問でしたが、確かに目的分子量のbandが出ていればそれ以上の正確性の担保はウエスタンの限界だと思いました。 結論として、同一メンブレンに比較検体とマーカーがあり、総蛋白染色がされていればポジネガが無くても、論文投稿等で問題ないデータになると考えてよいでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.11066-4 - 2022/12/23 (金) 22:27:50 - １ 常にNC, PCを並行して泳動してる人いるのかな？ 抗体の特異性がイマイチ疑わしいときとか（NCで確認できる）、シグナルが何も出ないとき（PCで確認できる）とかのケースでは確かにPCやNCは大変有用だけど、予測される位置に主たるシグナルが検出されててもNC,PCがないとそれが本物だとは信用しないとか言ってる人は過去にも現在も周囲には見かけないんだが。実際、本当にNCの試料作るならKDとかKOした細胞なり動物なりを準備しないといけないし、PCならば精製品を買うなり、リコンビナント作るなりして用意しないといけないし、皆さん抗体ごとにいちいちそんなことしてるのかな。 １つか２つの抗体だけしか使わない研究とかならそれも可能かもしれないけど、１回で５つも６つも抗体使う実験してると、現実的でないような気がする。常にPC NCを確認していれば成功するみたいなことは昔誰かが言ってたけど、それができれば一番いいんだが、この人は実際に自分でそういう実験してる人なのかなあと思った。 メンブレンは同一のブロットで比較しないと定量的な評価は難しい。例えばWET式の場合なら、同時に転写してもカセットが別だと転写され具合が違う（たぶんスポンジのつぶれ加減が影響）。またメンブレンがべつだとブロッキングや洗浄などの差異も影響する可能性がある。なので検体が多いときはゲルの半分くらいまでで泳動止めて１枚のメンブレンにゲル２枚乗せてブロッティングしてる。基本的に定量比較するものは工夫してでも可能な限り同一条件下で準備するようにしてる。 ローディングのコントロールというか補正には全部終わった後にCBBで総タンパク質染色してる。目指すタンパク質を検出しようとすると内在性コントロールは量が多すぎてシグナルが飽和気味になるのでローディングコントロールとしての役に立たない気がする。アクチンとかアプライ量倍にしてもバンドの方は同じくらいのシグナル強度だったりするし。いつも均一な量アプライできててますけどとかactinやGAPDHの太いバンドのブロットを自信持って見せてくれる人いるけど、いやいやそれそういうことじゃないんだがとかいうとムッとされるので最近は言わない。

(無題) 削除/引用 No.11066-3 - 2022/12/23 (金) 18:43:20 - G25 >１、ポジティブコントロールは精製蛋白が値段が高く 　使用した一次抗体が他論文で引用されていれば分子量マーカー確認のみで 　省略して大丈夫か ポジコン用の標品はサンプルからバンドが検出されなかったときに、本当に無いのか、あっても系がワークしてないから検出されないのかを切り分けるのには役立ちますが、有サンプルから検出されたバンドが目的のものかどうかを証明するものにはならないですよね（たまたま同じサイズの別のタンパク質に交差反応してるという可能性を否定できない）。その意味では、バンドが検出されているなら、標品はあってもなくてもおなじこと。 >２、ネガティブコントロールは他の発現しないだろう別組織を処理した蛋白を　使用してもよいのか、市販品の動物ライセートを使用すべきなのか 手間やコストがかかる割に有効なネガティブコントロールにはならないでしょう。見たいサンプルとできる限り同じ細胞、組織で標的タンパク質の有無のみことなるものでなきゃ。交差反応する別のタンパク質の有無をみてるだけになるかもしれない。この対照の目的は抗体が反応しているのは目的のタンパク質であり、交差反応している別物ではないってことですよね。 可能ならノックアウト、ノックダウンを使う。あるいは標品で吸収をかけたらバンドが減弱するとか、

(無題) 削除/引用 No.11066-2 - 2022/12/23 (金) 15:24:28 - おお >[Re:1] 凄く初心者さんは書きました : > > １、ポジティブコントロールは精製蛋白が値段が高く > 　使用した一次抗体が他論文で引用されていれば分子量マーカー確認のみで > 　省略して大丈夫か 精製タンパクがどのようにポジティブコントロールとして寄与するのかまずは考えてほしい。 その組織を使ったWBでその抗体を使ったデータがあるのなら必要とまでは言いません。 > ２、ネガティブコントロールは他の発現しないだろう別組織を処理した蛋白を　 > 　使用してもよいのか、市販品の動物ライセートを使用すべきなのか 発現しないだろうと言う予測であるならばネガコンとして使えません。 ポジコンネガコンは検出出来ている細胞と、その細胞からKDやKOした細胞の組み合わせが結果を見るのに解釈しやすいと思いますが、細胞と組織でその蛋白のサイズが違ったりすることはあります。 > ３、コントロール関係は過去のトピックを見させてもらうと > 　ポンソーs等の総蛋白染色が最も正確でeditarに文句を言われない 正確とまでは言わないが、通用する。要するにローディングコントロールとして示すのは、レーン間でcomparable である事を示すと言う事。 > 　ブロッティングの正確性の問題はあるにせよ同一サンプルの > 　別メンブレンのローディング比較でもよい。 ブロっティングの正確性ってなんだかわからないが、インターナルコントロールの検出は別の膜でもいいと言う認識です。 > ４、イメージングの際にメンブレンの端の方がかなり強く発色してしまい、 > 　均一な画像が出にくい > これは実験環境とかにもよるので必ずしもそうとまではいえない。

ウエスタンブロットで初歩的な疑問点 削除/引用 No.11066-1 - 2022/12/23 (金) 14:30:13 - 凄く初心者 マウス組織を処理後BCA法で濃度確認した後にSDS-PAGEを行いPVDFメンブレンでイムノスター LDを用いてケミルミを行い、写真袋に入れて、FUSION solo Sを使用してイメージングを行い、メジャーな蛋白(GFAP等)の比較定量を行っています、過去のトピック等も参考にいくつか初歩的な質問させて頂きます 同一メンブレンに必要な情報は 　分子量マーカー 　比較サンプル 　ネガティブコントロール(組織ライセートや別組織等) 　ポジティブコントロール 　ローディングコントロールや総蛋白染色　辺りかと思いますが、 １、ポジティブコントロールは精製蛋白が値段が高く 　使用した一次抗体が他論文で引用されていれば分子量マーカー確認のみで 　省略して大丈夫か ２、ネガティブコントロールは他の発現しないだろう別組織を処理した蛋白を　 　使用してもよいのか、市販品の動物ライセートを使用すべきなのか ３、コントロール関係は過去のトピックを見させてもらうと 　ポンソーs等の総蛋白染色が最も正確でeditarに文句を言われない 　ローディングコントロールは定量の正確性の問題があり、 　同一メンブレンのリブロッティングにこだわらず 　ブロッティングの正確性の問題はあるにせよ同一サンプルの 　別メンブレンのローディング比較でもよい。 　　という認識でよいか ４、イメージングの際にメンブレンの端の方がかなり強く発色してしまい、 　均一な画像が出にくい 感覚的な意見でも大変参考になります。少しでも助言頂けると助かります。

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