BioTechnicalフォーラム [co-IPの解釈に難渋しています。]

co-IPの解釈に難渋しています。

No.11059-TOPIC - 2022/12/21 (水) 12:32:51 - ひろ

co-IPを行い、WTと変異体2種の計3種類のタンパク質に結合するたんぱく質の量比を比較していますが、その解釈に難渋しています。
Flag-WT, Flag-MT1, Flag-MT2をベイトとしてタンパク質を落としてきてMassspectrometryで半定量解析しています。

今のところ、2種類の変異体には、WTと比較して、様々な核内タンパク質が1.5倍多く結合しているのですが、これが本当に正しい結果なのか、あるいはLysateの作成工程で、わずかな誤差を生み出してしまったのか、解釈に難渋しています。

もう一度うのがベストなのはわかるのですが、複数の抗体を購入して、別途IPをしなおすにせよ、Massからやり直すにせよ、どちらもかかる費用は膨大です。

何かアドバイスいただけないでしょうか？
　

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No.11059-11 - 2022/12/24 (土) 00:24:44 - BCG

SILACしようかなあと思って培地kitを注文しようとしたら、SILAC？ハア？もうこれからの時代はラベルフリーだろとかいうので、へえそういうものですかということでラベルフリーでやりましたがその結果をもとにいくつかの蛋白質をwestern blottingで検証したら結果が一致したのは半分以下で中には逆の結果もあって、なんだかなあということでやめてそれまたSILACをしました。したら、mass specの定量比較とWestern blottingは概ね一致した結果でした。

ラベルフリーが悪いのでなく外注先を間違えたのかもしれません。聞いたことない会社で他社よりやたら安くて、納期は余裕で１ヶ月以内とかいう話だったのに、再三催促して結果送られてくるまで結局半年かかりましたし。

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No.11059-10 - 2022/12/23 (金) 07:47:54 - コロロナ

ちなみにその「担保する」は誤用だと思います。

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No.11059-9 - 2022/12/23 (金) 05:16:42 - おお

IPーWBであれば１０cm Dish一枚で普通は十分です。またMASSのために条件検討しろというコメントはついてないように思えますが。

>外注先が、最新のmass specを持っていて、ラベルフリー定量的プロテオミクスが担保されているそうです。

だからといって、そのデーターだけで量が多い少ないの結果を鵜呑みする人は殆どないと思います。

(無題)

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No.11059-8 - 2022/12/23 (金) 04:49:22 - ひろ

全く持って言い訳ですが、
1回の実験の細胞必要量が半端ないので、条件検討するほどの余裕がないです。

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No.11059-7 - 2022/12/23 (金) 04:20:05 - ひろ

外注先が、最新のmass specを持っていて、ラベルフリー定量的プロテオミクスが担保されているそうです。

4 fragmentが検出されば、ピークの高さの比較で、定量値が出てくるそうです。
WTとMTで結構明確な傾向があるので、非常に悩ましいです。

dynabeadsでCo-IPを行っています。

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No.11059-6 - 2022/12/23 (金) 02:48:25 - おお

補足しておきますと、IPーWBで顕著に差が見れない場合、複合体の安定性を問うなら、IPフラクションを高い塩濃度で洗うなど少し揺さぶりをかけると差が見れる場合があります。塩濃度の他にはデタージェントとかですかね。

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No.11059-5 - 2022/12/21 (水) 19:06:21 - おお

>[Re:4] BCGさんは書きました :
> massは１回やればいいです。Massの結果のvalidationや再現性の確認はpull-down assay （Flag抗体でIPしたものをサンプルとして、Massのデータから、結合していると考えられるタンパク質に対する抗体でwestern)でできます。ただ何れにせよ0:100とか10:90とかくらいの差異がないとIPで定量的な議論をするのは技術的にも難しいと思います（IPの工程は長いので30::70とかくらいの量比の比較だとちょっとしたことでデータは動きます）。

私もそこが気になるところです。いずれにせよMASSのデーターはいろいろなタンパクを同時に見るために、実際の結合量比を正確に反映してないだろうから、IP -WBを一度やって見るといいと思います。
もしかしたら、結合しているであろうタンパクの抗体でIPしてFLAGでWBした方が差が出やすいかもしれません。

また、直接結合しているなら、両者のリコンビナントで結合を見るてもあります。

Cell lysatesでも、クロスリンクしてWBあるいはIP -WBで両者がコバレントに結合しているバンドが検出されるなら、フリーと結合しているもの比が見やすいので通常のIPｰWBより説得力があります。その他BNPAGEなどでコンプレックスを見るなど生化学的実験はある程度フレキシブルに立てられるので、感触があるものはさらにより説得力のある実験が組めると思います。

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No.11059-4 - 2022/12/21 (水) 16:24:46 - BCG

massは１回やればいいです。Massの結果のvalidationや再現性の確認はpull-down assay （Flag抗体でIPしたものをサンプルとして、Massのデータから、結合していると考えられるタンパク質に対する抗体でwestern)でできます。ただ何れにせよ0:100とか10:90とかくらいの差異がないとIPで定量的な議論をするのは技術的にも難しいと思います（IPの工程は長いので30::70とかくらいの量比の比較だとちょっとしたことでデータは動きます）。定量的に比較したいということであればSILACやラベルフリーなど定量的プロテオミクスで評価するしかないように思いますが、統計的な評価をするならば複数回しなくてはならず金額的にもあまり現実的ではないような気がします。

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No.11059-3 - 2022/12/21 (水) 14:29:22 - おお

IP MASSを繰り返しして再現性を見ようとしているのですか？あまり意味がないような気がします。varidationをするなら、IPしてその変異体で変化が見られたタンパク質のWBをするとか、注目するタンパクに限ったより直接的な方法をとるべきと個人的には思いますけど。

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No.11059-2 - 2022/12/21 (水) 13:47:23 - 774R

いずれにしてもn=1の半定量massを論文のデータにするには心もとないから、増えたと思われるタンパク質の抗体でWBをして定量するのは必要だと思います。

co-IPの解釈に難渋しています。

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No.11059-1 - 2022/12/21 (水) 12:32:51 - ひろ

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