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(無題) 削除/引用 No.11057-9 - 2022/12/22 (木) 12:25:49 - 補佐員 G25様 > LTRのような大きな反復配列をもつプラスミドで形質転換された大腸菌が生えないとか殖えないというのはよくあることで、むしろ何の工夫もなくすんなり殖えるというのは幸運だくらいに思っていていいくらい。 そうなんですね。これまでレンチ用のプラスミドは種類をそんなに扱ったことがないので勉強になります。 どちらかのコンピを購入してみます。 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.11057-8 - 2022/12/22 (木) 11:36:52 - G25 LTRのような大きな反復配列をもつプラスミドで形質転換された大腸菌が生えないとか殖えないというのはよくあることで、むしろ何の工夫もなくすんなり殖えるというのは幸運だくらいに思っていていいくらい。 そういうプラスミドに強い宿主株を使うというのが王道でしょう。 VectorBuilderが唯一提供している宿主もそうですね。 https://www.vectorbuilder.jp/products-services/product/hosutoda-chang-jun-nitsuite.html 遺伝子型をみるとこの株はNEBが同様の用途で売っているNEB Stableと同じものか非常に近い系統のようです。 https://www.nebj.jp/products/detail/1359

(無題) 削除/引用 No.11057-7 - 2022/12/21 (水) 11:38:23 - 補佐員 おお様 > DH5aでレンチのプラスミドを増やしたことありますし、特に増えないと言うことはありません。収量でこまったおぼえもないんだけどなぁ。 他のレンチプラスミドでは増えているので、ベクタービルダーのプラスミド自体がDH5aと相性が良くないのかと考えてます。

(無題) 削除/引用 No.11057-6 - 2022/12/21 (水) 11:34:52 - 補佐員 が様 > 経験的には、レンチプラスミドをDH5aにトランスフォームしても、コロニーは出ます。 > 選択薬剤を間違えているのでは？ 他のレンチプラスミドではコロニーはたくさん生えており、薬剤もAmpで間違えてはいません。 が様のようにプラスミドの種類によってコンピを変える必要があるのかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.11057-5 - 2022/12/21 (水) 11:04:30 - おお DH5aでレンチのプラスミドを増やしたことありますし、特に増えないと言うことはありません。収量でこまったおぼえもないんだけどなぁ。繰り返し配列の部分が不安定であるリスクが若干、Stbl3のようなコンピテントより高いぐらいです。コロニー2つ拾えば最悪でも一つはちゃんと機能するでしょう。

(無題) 削除/引用 No.11057-4 - 2022/12/21 (水) 10:53:03 - が ちなみに、DH5aは収量が少ないのであって、コロニーが１つの出現しない問題とは、別だと思います。 経験的には、レンチプラスミドをDH5aにトランスフォームしても、コロニーは出ます。 選択薬剤を間違えているのでは？

(無題) 削除/引用 No.11057-3 - 2022/12/21 (水) 10:31:49 - が レンチのプラスミドを増やすのはDH5aでは難しいです。たとえコロニーが出たとしても、レンチプラスミドとDH5aの組み合わせでは、plasmid DNAの収量が極端に少なくなります。 私達はshRNAレンチプラスミドは、NEBstableを使っています。

(無題) 削除/引用 No.11057-2 - 2022/12/21 (水) 10:27:39 - 補佐員 プラスミドの大きさは8.5kbpです。 同じ大きさのプラスミドを増やした実績はあります。

コンピテントセルについて 削除/引用 No.11057-1 - 2022/12/21 (水) 10:22:03 - 補佐員 いつも参考にさせて頂いてます。 現在、コンピテントセルとしてtakaraのDH5aを使用しているのですが最近購入したベクタービルダーのshRNAレンチのプラスミドではコロニーが1つも生えませんでした。同時に形質転換した他社のレンチ用プラスミドではコロニーができていたので操作自体は問題ないと考えております。 ベクタービルダー推奨のコンピテントセル（K-12株を最適化したもの）を使用しないと増えないのでしょうか？ 今までDH5aしか使用したことがないので、コンピテントセルや形質転換に詳しい方、ベクタービルダーで同様の経験がある方などアドバイス頂けますと幸いです。 よろしくお願いいたします。

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