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(無題) 削除/引用 No.11047-10 - 2022/12/18 (日) 12:41:24 - zam 標的抗原が核に「ない」という前提でコメントが重ねられているようですし、それはそれで有益ではありますが、そもそも核に「ない」ことは別の手法で裏取ってますか？ 細胞の種類や条件によっては、「ない」と言われていたものが「ある」ことはあり得ますからね。たとえそれが生理的なではないとしても。

(無題) 削除/引用 No.11047-9 - 2022/12/18 (日) 11:11:31 - G25 二次抗体だけでは何も染まらないとのことなので、一次抗体に起因する染色であることは確か。 ブロッキングや組織のプレパレーションが原因では無さそう。 確かにヤギ二次抗体なのにウマ血清でブロッキングというのは理屈にあってないけど(同種の血清に交差反応する抗体はないからこその血清によるブロッキング)。 一次抗体の非特異的吸着によるバックグラウンドじゃないかな。 一次抗体は濃度高めに設定することが多いので、非特異的吸着が高めになってるんじゃないかな。 一次抗体の希釈をもう一桁くらい上げてみては。抗原抗体反応は非特異的吸着よりKdが低いので、濃度を下げると非特異的吸着の方が速やかに減少する。希釈によってシグナル強度が下がるようなら、一次抗体の処理時間を延長して。

(無題) 削除/引用 No.11047-8 - 2022/12/17 (土) 17:12:01 - あの 細胞のディッシュやウェルへの接着具合はどうですか？ 細胞がはがれかけていると、核が染まっているように見えることがあります。

(無題) 削除/引用 No.11047-7 - 2022/12/16 (金) 23:03:00 - qq そうであれば、gout serumでblockingしてみるのが良いのではないかな。

(無題) 削除/引用 No.11047-6 - 2022/12/16 (金) 22:46:04 - D 皆様ありがとうございます。 抗原は細胞骨格系蛋白質(actinではないです）で、調べてもこれが核にあるという報告はありませんでした。 ２次抗体はgoat由来なのですが、goat serumが誰かが使ってしまった後注文してなくて、それでおととい発注したら納期がかかりますと言われたので、週末までに結果見たいと思い、別の実験でたまたま持っていたhorse serumを使いました。この抗体は先週届いたばかりで使うのが初めてで、まだ他の条件ではやってません。細胞骨格なら普通に冷メタノールでしょ、とかさっきどっかのサイトで書いてるのを見たのですが固定はメタノールとかの方がいいでしょうか。 同じような条件で３種類の抗体（どれも細胞骨格系蛋白質）でIFしたのですが、どれも見たいものに加えて核が染まる（そのうち一つはスペックルっぽい感じです、それ以外は核全体が弱めに綺麗に染まる感じ。）ので、１次抗体以外に原因があるのかなあとか思いました。 細胞はヒトがん細胞株で、ややマイナーであまり広く使われていないものです。

(無題) 削除/引用 No.11047-5 - 2022/12/16 (金) 21:23:16 - qq >普段と違うのはブロッキングをgoatからhorse serumに変えたくらいです。 ということは、goat由来の二次抗体からhorse由来の二次抗体に変えたということなのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.11047-4 - 2022/12/16 (金) 19:58:26 - toto NIH3T3細胞をこの前染めたら、抗原とは関係ないのに核がよく染まってましたが、細胞と条件によってたまにそうなることがあります。そういえば以前、side-by-sideでどのブロッカーがいいのか調べたことがありましたが、なぜかhourse serumでは結構高いバックが観察されました。最近では2%BSAだけにしてます。

(無題) 削除/引用 No.11047-3 - 2022/12/16 (金) 17:40:42 - おお 一度normal IgGなど使って見るのもありかも知れません。ノンスペならデタージェントを工夫するとか, 抗体反応時間を短くするとか、出来ることは色々あると思うけど、、、

(無題) 削除/引用 No.11047-2 - 2022/12/16 (金) 17:33:47 - おお まず、核に局在する事を否定出来ますか？ ミトコンドリアのタンパクがかくにあったり、細胞膜にあるものが刺激で一部切断されて核に移行したり、分泌されるgrowth factor がなぜか核でも検出されたりもします。結論ありきというのは危ういです。今は核タンパクのプロテオミクスも色々やられているのである意味やり易いかも知れません。 同じタンパクに対する違う抗体は試しましたか？ そのタンパクが何か開示できますか？

蛍光抗体法で培養細胞の染色したらいつも核が染まります。 削除/引用 No.11047-1 - 2022/12/16 (金) 16:37:55 - D 蛍光抗体法で培養細胞の染色をしています。異なる３種類の抗体で染色しているのですが、本来の抗原蛋白質の局在に合致した明瞭なシグナルに加えて、いずれの抗体でも同じようにやや弱めに核が染まります。２次抗体単独では何も染まりません。３つの抗体の抗原は互いに基本的にあまり関わりのない分子です。原因について思い当たることあれば教えてください。固定は4%PFA-PBS 室温5 分。　ブロッキング　5% horse serum-PBS, 透過処理あり、抗体反応4℃一晩です。普段と違うのはブロッキングをgoatからhorse serumに変えたくらいです。

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