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(無題) 削除/引用 No.11044-11 - 2022/12/23 (金) 22:58:20 - drop 重ねての返信で大変申し訳無いのですが、最初の私の返信でG25様とおお様を間違えておりました。 別トピックと勘違いした誤記でした。 G25様、大変申し訳ございませんでした。

(無題) 削除/引用 No.11044-10 - 2022/12/23 (金) 22:46:53 - drop G25様 ありがとうございます、「実験を行う現場が汚染される」という視点が抜け落ちておりました。 ようやく合点がいきました。これはUNG酵素を入れなければならない系ですね。 スレ主様、G25様にはご迷惑をおかけし申し訳ございませんでした。

(無題) 削除/引用 No.11044-9 - 2022/12/22 (木) 21:46:26 - G25 キャリーオーバーはノンスペとは違うんだな。わかるよね。 プロジェクトの中で同じアンプリコンのPCRをルーチンにやるようになるとたっぷり増えたPCR産物で実験環境が濃厚汚染されてくる。PCR産物の汚染が次の反応に持ち込まれると、汚染由来の「スペシフィックな」PCR反応で増幅してしまう。 コロナウイルスのPCR検査なんかでももっとも神経が使われているポイント。

(無題) 削除/引用 No.11044-8 - 2022/12/22 (木) 20:29:27 - drop toki様 亀レス失礼いたしました。 ノンスペの可能性を下げるため、とのこと、当方も勉強になりました。 お目汚し失礼いたしました。

(無題) 削除/引用 No.11044-7 - 2022/12/16 (金) 20:24:49 - toki G25さま ご連絡ありがとうございます。 UNG試薬で間違いなさそうですね！ 前処理でdUTPが分解されるのですね、大変納得です。ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.11044-6 - 2022/12/16 (金) 10:11:51 - G25 説明書や作業マニュアルを確認しました。 2×Environmental Master Mix 2.0にはUNGは含まれていませんが、必要な場合に加えてPCR産物のキャリーオーバーの抑止できるようにdUTPは予め混合されているようです。 作業マニュアルでは反応系にUNGを添加するプロトコールになっていますから、UNG反応のための50℃インキュベーションを入れなきゃ意味がない。 ちなみにそのあと95℃, 10 minの前処理は、使用されている改変型Taq polであるAmpliTaq　Goldが加熱処理しないと活性化しないようにできているからですね（と同時にUNGを熱失活させる）。他の酵素だとそんなに長時間の前処理は必要ないです。

(無題) 削除/引用 No.11044-4 - 2022/12/16 (金) 00:57:54 - toki G25さま、dropさま ご返信ありがとうございます。 G25さまの言う通り、UNG酵素の活性化ステップのようです。納得しました。 dropさま、やはりqPCRである以上、非得意的な検出の可能性を少しでも下げるという理由では不十分でしょうか？

(無題) 削除/引用 No.11044-3 - 2022/12/15 (木) 23:32:02 - drop 環境DNA学会のマニュアルはこちらですか https://ednasociety.org/wp-content/uploads/2022/06/eDNA_manual_ver2_2.pdf 50℃2分は、おお様の仰る通りUNGのためのインキュベーションかと思います。 ただ、マニュアルだけを見る限りUNG酵素が必要な系には思えません… 単離にNested PCRを使っているわけでもなし、プローブで定量した後なにかするわけでもなし…？

(無題) 削除/引用 No.11044-2 - 2022/12/15 (木) 23:18:29 - G25 Uracil-DNA Glycosylase (UNG) を働かせるインキュベーションでは？ PCR産物のキャリーオーバーを防ぐためにPCRにdUTPを加えておくと、後のPCR反応にキャリーオーバーがあっても、事前にUNGを働かせると分解できます。 qPCR用のプレミックスには予めdUTPとUNGが加えてあるものもあります。 その作業マニュアルやや使用している試薬の説明書を気をつけて読んで確認してください。

環境DNAにおけるqPCRの変性温度 削除/引用 No.11044-1 - 2022/12/15 (木) 22:09:55 - toki 初めて投稿させていただきます。 少しわからない点があり、質問させていただきます。 これからの予定ですが、環境DNAの種特異的DNAの検出系の実験をラボで行おうと思ってます。 試薬は、TaqMan™ Environmental Master Mix 2.0を使用して、機器はタカラのTaKaRa PCR Thermal Cycler Diceを使用予定です。 環境DNA学会が公開している作業マニュアルでは、温度プロトコルについて下記のように記載しています。 [５０℃で 2 分、95℃で 10 分の初期ステップの後、95℃で 15 秒、60℃で 1 分から59なるサイクルを 50-55 回程度繰り返す。] もちろん、上記はあくまでプロトコルの一例なのでしょうが、最初の50℃で2分間のステップの意味がよくわかりませんでした。 もしわかる方いればご教授ください。 よろしくお願い致します。

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