全6件 ( 1 〜 6 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.11038-6 - 2022/12/15 (木) 09:04:23 - おお 正直申し上げると、プロモーター、エンハンサーが働いているプラスミドやConstitutiveなプロモーターをつかったCMVとかSV40とかの下流にLucがあればブランクの取り方が指摘のどちらでも大きな違いが出ません。Renilla lucでお示しのデーターはBlank引くか引かないかで２倍ものさがでるので、Lysateの活性が低すぎないかと思います。少なくともアッセイできるほどの活性はないとも言えます。ですからトランスフェクションの効率をまずは疑ってます。あるいはLysateの作り方とかなのかもしれません。 もちろんトランスフェクションが難しい細胞もあるでしょうけど、それでも低すぎると思います。 機械によってカウントの出方は違うし、スケールもちがうのでなんとも言えませんが、数秒のカウントで強いものでは数十万のカウントがでて、ミニマムプロモーターでも１０００ぐらいは出てたと思う。検出時間が制御できない手物にあるマイクロプレートリーダータイプでもそこそこ活性があれば１０００ぐらいは出るんじゃないかと。 Renilla lucはConstitutiveなプロモーターではありますが、TF過剰発現などで多少変動することはあります。測定で結論が出しにくいほど変わるなら他のConstitutiveなプロモーターを使うなど工夫が必要かもしれません。

(無題) 削除/引用 No.11038-5 - 2022/12/15 (木) 08:21:17 - 774 おおさんの指摘のように、Lucがない細胞をBGとするのがベストですが、私の場合はあまり違いがない・サンプルとの違いが大きいのでLysisバッファーで代用してます。（これは細胞と基質次第かもしれません） Fireflyの光の残存やRenilla検出に不安があるようでしたら、それぞれ単独のトランスフェクションのサンプルを用意すればはっきりするでしょう。 基質を節約したいところですが、不安を抱えながら続けるよりも、一度確認するのがいいと思います。 現状のデータで結論を出すのは難しいと思います。私ならこの結果はポジティブっぽいから、さらに条件検討して確認する。という方向で進めると思います。

(無題) 削除/引用 No.11038-4 - 2022/12/15 (木) 03:03:44 - おお 測定機器によるのでどうかわかりませんが、トランスフェクションの効率が非常に悪いように見えます。まずはGFPなどで、トランスフェクションの条件を最適化した方がいいでしょう。 ブランクはすでに指摘があるように基質は最低限必要です。基質とトランスフェクションなし(あるいはルシフェラーぜプラスミドなしのトランスフェクションした)細胞のlysatesと基質を使うのがベターです。

(無題) 削除/引用 No.11038-3 - 2022/12/14 (水) 19:07:47 - Lucアッセイ 774様 コメントいただき、ありがとうございます。 とても嬉しいです。 blankをそのように置いてしまったのは試薬を少しでも節約するためなのですが、不適切でした。 次回からは774様の方法に従います。ありがとうございます。 プラスミドに関してですが、48 wellプレートに細胞を40,000 cells撒き、翌日そこへ FuGene 4K 0.9 ulに対して、pGL3 (0.2 ug), TF (0.06 ug), pRL-tk (0.04 ug)を加えています。 FuGene 4K 0.9 ulに対して、DNA 0.3 ugという計算でして、比率はマニュアルに従ったものですが、pRL-tkが確かに低いのは感じておりました。 一つ気になるのが、Renilla lucの活性が4と5番目で2回繰り返しても必ず高い傾向です。 ひょっとしてFirefly lucの発光が残っていて、それを測定してしまっていないか？ Renilla lucの検出がワークしていないのか？とも考えております。 私の今あるデータで、どちらで析するのがまだましなレベルでしょうか？ 次回からは774様のblankを置きます。

(無題) 削除/引用 No.11038-2 - 2022/12/14 (水) 18:34:21 - 774 私はサンプルと同じ様にLysisバッファーのみに基質を加えて測定したものをBGとして引いてます。 Lucアッセイさんのデータはblankとサンプルの測定値の差が小さい気がします。 もう少しplasmidの量を増やすなりして、測定値を大きくする方がいいように思いますが、いかがでしょうか。

Lucアッセイの補正の仕方について、教えてください。 削除/引用 No.11038-1 - 2022/12/14 (水) 17:32:14 - Lucアッセイ お世話になります。 ある遺伝子のプロモーター解析をしています。解析で悩んでいるため、ご教示いただけましたら幸いです。 ある遺伝子Xの発現には転写因子TFが関与することから、Xの転写開始点上流1 kbをpGL3にクローニングしました。 また、そのプラスミドからTF結合サイトを潰した変異体も作製しました。 そこで以下の５つのサンプルを作製しました。 1. pGL3のみ 2. pGL3+promoter + empty plasmid 3. pGL3+promoter(TF site deleted) + empty plasmid 4. pGL3+promoter + TF過剰発現plasmid 5. pGL3+promoter(TF site deleted) + TF過剰発現plasmid Firefly lucをはじめに検出すると、順番に、30, 90, 70, 370, 240となりました。 またこの時、使用していない空のwellをblank目的で検出すると10でした。 ここまではRenillaで補正をする前ですが、とても仮説を支持する綺麗なデータかと思います。 一方Renilla lucをみると、その値は、30, 20, 20, 50, 60でした。 またこの時、使用していない空のwellをblank目的で検出すると10でした。 以上のデータを用いて解析してみると、 各Firefly lucからblankを引いて、20, 80, 60, 360, 230となり、 各Renilla lucからblankを引いて、20, 10, 10, 40, 50となり、 上を下で割り算すると順に、1, 8, 6, 9, 4.6となってしまいまして、4つ目のサンプルで上がる傾向が消えてしまいました。 そこで解析の仕方として、blankを引くことをやめてみたところ、 各Firefly lucの値が順に30, 90, 70, 370, 240 各Renilla lucの値が順に30, 20, 20, 50, 60なので、 上を下で割り算すると順に、1, 4.5, 1, 7.4, 4となり、仮説通り4つ目のサンプルで上がる傾向が確認できました。 ただ、正直どちらの解析の仕方が正しいのか自信が持てません。 そもそもblankとして使用しているのは空のwellで、PBSが入ってるでも基質だけが入ってるのでもないので、不適切だとも思っていますが、皆様はどう解析されているのか、ご教示いただけませんでしょうか？ 何卒よろしくお願いいたします。

全6件 ( 1 〜 6 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する 名前  メール  　アドレス非公開    タイトル  本文       設定  クッキーを保存（次回の入力の手間を省けます） 上に上げない（トピックの一覧で一番上に移動させません） 解決（問題が解決した際にチェックしてください） 暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。 送信

---

〔使い方〕 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。

---