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(無題) 削除/引用 No.11035-6 - 2022/12/17 (土) 10:17:30 - おお >[Re:5] qqさんは書きました : > 普通、wortmanninはPI3K阻害剤として添加する。 >[Re:4] さとさんは書きました : > 調べてみるとwortmanninというリン酸化阻害剤をlysis bufferに添加している方もいるのですが、タンパク質の濃度測定はせずに、接着している細胞に直接SDSバッファーを添加するなら、こういった薬剤は不要ですよね？ wortmannin が使われるようになる前からこの手の実験はされてますからね。SDSなど強力な変性剤で熱変性までさせるなら、必要はないでしょう。入れるとしたらNaFとかOrthovanadateとかでいいと思います。あ、OrthovanadateはDTTとは相性悪いね。。。 wortmanninは高濃度でProtein kinaseも阻害する言う話があるようですが説明は詳しい人に譲ります。

(無題) 削除/引用 No.11035-5 - 2022/12/17 (土) 09:04:56 - qq 普通、wortmanninはPI3K阻害剤として添加する。

(無題) 削除/引用 No.11035-4 - 2022/12/17 (土) 02:55:11 - さと 調べてみるとwortmanninというリン酸化阻害剤をlysis bufferに添加している方もいるのですが、タンパク質の濃度測定はせずに、接着している細胞に直接SDSバッファーを添加するなら、こういった薬剤は不要ですよね？

(無題) 削除/引用 No.11035-3 - 2022/12/14 (水) 09:25:53 - おお あ、ただしあなたの実験でこれが妥当かどうかはご自身で考えてください。

(無題) 削除/引用 No.11035-2 - 2022/12/14 (水) 04:40:51 - おお ...the cells were serum starved (0.5% fetal bovine serum in Dulbecco's modified Eagle's medium) for 4 to 6 h to facilitate the accumulation of inactive EGF receptors at the cell surface. The cells then were stimulated at 37°C with 100 ng/ml EGF (17 nM; Sigma) for the periods indicated. https://journals.asm.org/doi/10.1128/MCB.02356-05 この手の実験は血清を抜くか非常に低い血清濃度でしばらく培養してリン酸化フォームを極力減らしてから刺激するのが一般的なやり方です。

Hek293tにEGFを加えても何も変化しない。 削除/引用 No.11035-1 - 2022/12/14 (水) 01:43:37 - さと Hek293tの通常の培養液にEGFを加えても、リン酸化の変化が何も見られません。MAPK EGFR JAK等を調べました。 論文のマテメソには、細かな記載はないのですが、FBSを抜いたり、何かやり方の問題でしょうか？ 時間はといあえず、どの論文でも何かしら差がありそうな30分を採用しています。

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