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(無題) 削除/引用 No.11020-6 - 2022/12/09 (金) 02:09:46 - あふ なんとなく負け戦な予感がします。小手先の工夫で劇的な改善は見込めない気がするので、自分だったら、111さんがおっしゃるように抗体を変更すると思います。 が、現実的にはそうもいかないこともありますよね。私は抗体は半期に1個しか買えないラボで育ったので、抗原賦活化処理に目が行きますね。クエン酸バッファーで煮るのが一般的でしょうか。 煮たときに、切片や細胞が剥がれてボロボロになるのは、自分も経験があります。これを回避するには、バッファを沸騰させないことが肝要ですね。

(無題) 削除/引用 No.11020-5 - 2022/12/08 (木) 12:09:00 - １１１ 方法拝見しました。 私たちとは細部において異なるところはありますが、他の抗体ではうまく染まっているとのことなので、方法には本質的な問題はないものと思います。WBではうまくいっていて、免疫組織染色(IHC)で染まりが悪く（一晩以上かかるなどの点）細胞の蛍光抗体法による染色(IF)では染まらないということですので、使用している抗体がWBには使えるが、IHCやIFには使えない抗体なのだと思います。これは割とよくあることで、特にモノクローナル抗体やモノスペシフィックなポリクローナル抗体ではたまにそういう経験をします。もともと抗体の認識するエピトープが天然状態では、分子内部にあるか、周辺構造による立体障害など、抗体がアクセスしにくい部位にあるものと思われます。さらにPFA固定することでこうした問題はさらに強く現れるように思います。 WBではタンパク質は完全に変性していますので、こうした問題は起こりませんので、綺麗に染まったのでしょう。 これは使用している抗体の特性に起因する問題ですので、抗体を変えるのが（IHC, IFに適用可能であることがデータ付きで出ているものにする）一番の解決方法ですが、どうしてもそれが難しければ、抗原賦活処理を試してみられることを勧めます。（PFAによるメチレン架橋を切断したり、蛋白質の高次構造を崩してエピトープを露出させ抗体がアクセスできるようにする方法）培養細胞ではあまりしませんが、PFA固定したIHCでは普通に行われており、しばしば劇的に抗体染色性が改善します。低いもしくは高いpHのbuffer中で加熱するなど激しい方法なので、普通のガラスだと細胞/組織が剥がれてしまうので、剥離防止スライドグラス などを使用することが望ましいとおもいます。

(無題) 削除/引用 No.11020-4 - 2022/12/07 (水) 23:24:21 - み 組織染色でも染まりが悪いので一晩反応させないと駄目という答えをお持ちじゃないですか。 同様の方法でやって駄目なら改めて解決方法を考えれば良いでしょう。 westernの変性蛋白に対する反応性は良いけど、高次構造を保った蛋白には時間を要する抗体ということでしょう。 固定条件が１パーセントPFA１０分ということですから最低限の処理しかされていないし過固定ではない。勿論MeOH固定など他の固定方法で反応性が改善される可能性は否定しない。

(無題) 削除/引用 No.11020-3 - 2022/12/07 (水) 22:26:15 - D １１１様 ありがとうございます。 1. 細胞をガラススリップ上に播種 2. 翌日、培地を除去し、１％ PFA in PBS, 10 min fixation 3. PBSで3回wash後、5% BSA 0.05% Triton X-100 in PBSで1 hr blockingとpermeabilization 4. 1˚Ab (5 ug/ml) in blocking buffer, R.T. 1 hr 5. Wash with PBS, 4 times 6. Cy5-anti-rabbit IgG (1:500) in blocking buffer, 45 min, R.T. 7. Wash with PBS, 4 times 8. DAPI入りmount mediaを乗せたスライドグラスに封入 この方法で一次抗体を同じrabbit由来のHPRTは綺麗に染まっているので、二次抗体はワークすること、HPRTが染まることから膜透過性はあること、顕微鏡のセッティングも問題ないこと等確認できています。 ウエスタンだと短時間でしっかり強いバンドが出ますし、ノックアウトでは消えるので抗体も特異的です。 ただ免疫染色は組織では非常に染まりが悪いです。一晩以上の染色で再現性良く組織が染まり、その染色はノックアウトで消えるので、抗体の免疫染色用途も特異的だと考えています。 今回、単層細胞の染色は1時間室温で行いましたが、オーバーナイト染色で変わるでしょうか？というのが質問です。 よろしくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.11020-2 - 2022/12/07 (水) 21:32:06 - １１１ 細胞の染色の具体的な手順を書かれた方が原因が見つかりやすいと思われます。 特に、固定と透過処理の有無および方法について。

細胞染色について 削除/引用 No.11020-1 - 2022/12/07 (水) 21:22:48 - D 質問させてください。 これまでマウス組織の蛍光免疫染色を行って来ました。 whole mount染色など、厚めの組織の染色の経験があります。 最近取り組んでいるのが、培養細胞株の免疫染色です。 対象抗原は高濃度の抗体で２日間、４度での染（ホールマウントですが）色を要するようなものでした。 今回、培養細胞株ということで1時間室温でも十分だろうと考え、そのようにしてみましたが、全く染まりませんでした。その培養株細胞ではその分子が発現していることをウエスタンで確認しています。 そこで私の質問は、 monolayer細胞であったとしても一晩４度での染色などおこなったりするのでしょうか？ 私の周りはみんなmonolayer細胞であれば室温数時間程度です。 ご教示いただけたら幸いです。

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