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(無題) 削除/引用 No.10993-12 - 2022/12/09 (金) 06:46:08 - 釣菌 >momo様 穿刺部の周辺に白い小さな粒上のものがみえました（数は多くはありませんでした）ので問題ないものなのかなと判断し画線を試みた次第です。

(無題) 削除/引用 No.10993-11 - 2022/12/06 (火) 15:01:14 - momo 届いたスタブの穿刺された穴の周りにバクテリアが増殖した形跡はあったのでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.10993-10 - 2022/12/06 (火) 08:07:47 - 釣菌 皆様 ありがとうございました。リポジトリに連絡して別ロットを再送いただくことになりそうです。並行して試しに残りの培地から菌およびプラスミドのレスキューを試みました（当方はプラスミドが取れればOKでした）が抗生物質耐性の菌は増殖してこなかったです。ファージ感染があったのでしょうかね。 プラスミド全長が必要だったのでPCRでのリカバリは試みていません。また、釣菌の際は培地に突き刺された線を確認しながら行ったため、それが原因ではないかなと思っていますが、引き続き気をつけて作業しようと思います。

(無題) 削除/引用 No.10993-9 - 2022/12/02 (金) 10:35:40 - wwn グリセロールストックと勘違いしていました。 穿刺培養って書いてあるのに思い込みしていました。 増えない理由として、ファージ感染の疑いなどはないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.10993-8 - 2022/12/02 (金) 05:19:08 - DNA スタブの線を目で見て狙い撃ちしていますか？ 1本線が見えるので、そこを狙わないと、大腸菌はいません。

(無題) 削除/引用 No.10993-7 - 2022/12/01 (木) 11:48:34 - mp 単純にplasmidにcloningされているcDNAが欲しいとかであれば、大腸菌の死骸からでもPCRで増やせると思いますが、そうじゃ無いんですよね？

(無題) 削除/引用 No.10993-6 - 2022/12/01 (木) 10:49:23 - wwn 凍ったグリセロール上部を少し取るだけでは増殖しないようなものでも、歯科用の歯石取りのような頑丈なもので底のほうを削り取りプレートにまくことでしかコロニーが出ないようなものもありました。 表面が凍結融解を繰り返してしまっているのか、分注後に沈んでいるのかはわかりませんが。 なおこのようなことを経験しているのは96ウェルプレートのものです。

(無題) 削除/引用 No.10993-5 - 2022/11/29 (火) 11:49:01 - おお >[Re:3] 釣菌さんは書きました : > >おお様 > > ありがとうございます！スタブの中に液体培地を入れてそのままミニプレにもっていくということですね、穿刺部分をこすり取ってLB中で振とう培養してからミニプレという手もあるのかな考えていましたが、ダイレクトにミニプレも考慮してみたいと思います。 死んでたら増えないですからね。 それと指摘があるようにご自身がストックしたとかでない場合は入手先に連絡したほうがいいですよ。

(無題) 削除/引用 No.10993-4 - 2022/11/29 (火) 11:30:32 - -- 余計なことをせずにリポジトリに連絡してください。 トラブルが合った場合、通常は無償で再送してくれます。 リポジトリ側としても、不具合があったロットの情報は重要ですので。

(無題) 削除/引用 No.10993-3 - 2022/11/29 (火) 08:28:45 - 釣菌 >おお様 ありがとうございます！スタブの中に液体培地を入れてそのままミニプレにもっていくということですね、穿刺部分をこすり取ってLB中で振とう培養してからミニプレという手もあるのかな考えていましたが、ダイレクトにミニプレも考慮してみたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.10993-2 - 2022/11/29 (火) 06:51:23 - おお 本当の最後の手段としては、そのスタブにLBなどをかけて激しくふるなどして、そこにある菌体をできるだけ回収して、ミニプレップしてTransfection。 グリセロールストックで増えなくて困った人がそうしてました。なんとかそれでプラスミドを得ることができたそうです。

スタブから画線した大腸菌が生えない 削除/引用 No.10993-1 - 2022/11/29 (火) 04:20:57 - 釣菌 リポジトリからスタブで入手した大腸菌をLBプレート上に画線して一晩インキュベートしたのですが何も生えてこなくて対処法を考えています。状況は下記です。 ・大腸菌はアンピシリン(Amp)耐性のプラスミドを持ち30℃での培養を推奨されているもの ・Amp（50mg/ml）入りの市販LBプレート上に滅菌10ulチップを使って画線 ・30℃インキュベータで培養するも翌日コロニーなし ・37℃インキュベータで培養しても翌日コロニーなし ・抗生物質を含まないLBプレート上に画線し30℃もしくは37℃インキュベータで培養しても翌日コロニーなし という状況で、抗生物質を含まないプレートでも何も生えてこなかったことから次のステップに何を試したらよいか思案しています、助言いただけたらと思います。 スタブからの画線培養については私は経験が多くはないのですが、同様の方法で培養〜プラスミド回収までは複数回経験があり、このような状況に陥ったのは今回初めてです。よろしくおねがいします。

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