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(無題) 削除/引用 No.10991-4 - 2022/11/29 (火) 01:05:21 - おお >[Re:3] mmさんは書きました : > 説明ありがとうございます。 > 途中で無血清培地を変えると基本的には、Transfectionはそこで中止することになりますよね。一方血清培地でTranfectionしていれば、多少効率は悪くても48時間Transfectionを続けることになりますよね。 > > そう考えるとどちらも同じ気もします。 リポフェくタミンが開発された当初は、Transfection後、数時間からOver nightで培地を交換するというのが基本プロトコールとなっていました。リポフェくタミンの細胞への影響が未知数であったり、長期間の処理で細胞が死んだりすることがあるのがその理由だと思います。 しかしながら、おそらく社内の色々な検討などから、特に死ぬとかよほど細胞に見た目の変化がない限り入れっぱなしでいいという結論に至ったのだと思います。また更に改良も加えられていたり、目的に特化している商品も出てますし。ただしどんなときも入れっぱなしでいいかというとそれはあなたの実験系で調べてみるほうがいいかと思います。とくに分化を促進したいときとか、分化しやすい細胞だったりとかのばあい。 感触としてはよく入る細胞でプラスミドをいれた経験しかありませんが、入れっぱなしでも培地を変えてもそんなに大差がなかった記憶はあります。ただしRNAiとかであれば見た目にタンパク量が減るには時間がかかりますので入れっぱなしで細胞にダメージがないならそれでいいかと思います。

(無題) 削除/引用 No.10991-3 - 2022/11/29 (火) 00:38:12 - mm 説明ありがとうございます。 途中で無血清培地を変えると基本的には、Transfectionはそこで中止することになりますよね。一方血清培地でTranfectionしていれば、多少効率は悪くても48時間Transfectionを続けることになりますよね。 そう考えるとどちらも同じ気もします。

(無題) 削除/引用 No.10991-2 - 2022/11/28 (月) 15:42:05 - おお 全く書かれてないわけで無く、前日にGrowth mediaでまき、翌日それに試薬RNAｍｉｘを加えると書いています。 通常の細胞増殖させて維持している培地を使う実験ならその培地を使えばいいです。勿論、分化させる、あるいはした細胞に導入したければその培地を使うべきでしょう。 ただしこの手の試薬は昔は無血清の培地にする方が効率がいいなどとされていて、無血清培地を勧めていたこともあって、導入用に通常の無血清培地より細胞に影響を与えにくいｏｐｔｉMEMが開発されたのだと思っています。ｏｐｔｉMEMはそのまま使っても数時間は増殖に影響を与えるますが、無血清DMEMより細胞の状態をよりよく維持する事ができますので、導入数時間前に培地をｏｐｔｉMEMに交換するのもオプションとして有り得るやり方だと思います。また、ｏｐｔｉMEMは1から2%ぐらいの血清で細胞を増殖、維持できるので、撒くときから使うてもあると思います。 ただし血清を下げる事で毒性が顕著に出る場合もあるので、通常の細胞増殖させて維持している培地を使うのもオプションとしてありと言う事だと思います。数時間後に培地交換しても良いと言うのも毒性などの影響を考慮したものでしょう。マニュアルには特にｏｐｔｉMEMをに交換すると書かれていないので、通常の細胞増殖させて維持している培地で大抵は十分な導入が可能ののだと思います。 また、確か文献で発表されているプロトコールを細胞ごとにデーターベース化してあった様な気がしますので、あなたの細胞がリストにあるか確認してみるといいです。培地を交換したのかなどリファレンスなどから具体的方法が確認できるかもしれません(ただしそれがあなたの実験環境でベストかはわかりません)。

Lipofectamine RNAiMaxの使い方 削除/引用 No.10991-1 - 2022/11/28 (月) 14:44:28 - mm Lipofectamine RNAiMaxの使い方で質問があります。 stealthRNAiを使用して、ヒトの接着細胞のとある遺伝子を阻害する実験を行っています。当然ながら、添付のマニュアルに沿って実験しているのですが、肝心の部分が抜けている気がしていて、ここで質問させていただきます。 Forward transfectionとReverse transfectionの2種類のやり方があるので両者を行っています。 質問としては、transfection中の培養液に何を使うのかです。RNAiを溶解するのはOptimem reduced serumを使うのは間違っていないと思うのですが、その後培養液は何を使えばいいのでしょうか。全くプロトコールに書かれていません。 googleで検索をかけるとresearchgateにForward transfectionの問答？があって、Optimemを最初の4-6時間使って、その後は、通常の培地に戻すという記述もあるのですが、元のマニュアルを見る限りはそんな記載は一切ありません。また、Reverseの場合は、細胞が接着していないので、どの培地を使っていいのか、さらに悩みます。 使用した経験のある方いらっしゃいますでしょうか？

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