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(無題) 削除/引用 No.10981-6 - 2022/11/24 (木) 13:41:22 - G25 >いやいや、それを疑うなら電気泳動してみなさいと言う指摘です。 代弁ありがとうございます。 泳動してみてOCが大したことなければ私の指摘はあたっていないし、ひどければ原因である可能性があるってことです。 >4-6kbp程度のプラスミドでさらに、目的の遺伝子領域にそんなにニックが入るものでしょうか。。 で、泳動してみてOCが目立っていたなら、nickingが進んでいるのは明らか。 OCになっているということはプラスミド一分子に一個以上のnickが入っているわけで、4-6kbpのうち目的遺伝子がどれだけ占めているかわかりませんが、2 kbとしたら、一個のnickが目的遺伝子上に落ちる確率は1/2-1/3もある。 cccはトポイソメラーゼがDNA鎖を切断しATPのエネルギーを使って巻きを強めて再結合されているわけで、自由エネルギーが高い状態になっています。なので自発的に自由エネルギーが低くなる方、つまりnickがはいってOCになる傾向があります。

(無題) 削除/引用 No.10981-5 - 2022/11/24 (木) 13:14:13 - おお 精製がしっかりとしているなら、4度で年単位でもつと思う。特にEDTAが入っていたなら。 キットできれいなDNAが取れるのかもしれないけど、それはトランスフェクションと言う観点からであったりもするから、それぞれのキットで保証できませんけど。

(無題) 削除/引用 No.10981-4 - 2022/11/24 (木) 13:04:40 - おお >[Re:3] かかさんは書きました : > つまり、かなりダメージを受けている可能性が高いということですかね？？ いやいや、それを疑うなら電気泳動してみなさいと言う指摘です。

(無題) 削除/引用 No.10981-3 - 2022/11/24 (木) 12:09:53 - かか つまり、かなりダメージを受けている可能性が高いということですかね？？ 4-6kbp程度のプラスミドでさらに、目的の遺伝子領域にそんなにニックが入るものでしょうか。。。

(無題) 削除/引用 No.10981-2 - 2022/11/24 (木) 11:50:30 - G25 制限消化せずそのまま泳動すると如実にわかります。 cccに比してOCの割合が多くなってくる。つまりnickをもつ分子や一分子中のニックが増える。 大腸菌をトランスフォーメーションするくらいなら、ニックの入ったプラスミドでも大腸菌内で修復され、あまつさえ複製されて新生するので問題ない。 しかし、導入したプラスミが直接、転写されることを狙ったトランスフェクションでは？　nickが入ったプラスミドは良い鋳型にならないだろうし、宿主細胞の修復系によってどれだけ回復するかは未知。

Plasmidの劣化、、、 削除/引用 No.10981-1 - 2022/11/24 (木) 11:29:33 - かか transfectionを行っているのですが、プラスミドは凍結融解による劣化を受けますか。15回程度のはずですが、、、効率が下がってきた気がします。 ゲノムDNAならともかく、プラスミドがトランスフェクション効率を下げるほどのダメージを受けるのでしょうか。 分注しなかったことを、今思うと失敗したなと思います。。。

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