BioTechnicalフォーラム [リン酸化抗体が、検出できない。]

リン酸化抗体が、検出できない。

No.10974-TOPIC - 2022/11/21 (月) 08:08:10 - さと

JAK-STATシグナルをみたいのですが、JAKのリン酸化が上手く検出できません。いずれの、アイソフォームも。
他の興味のあるリン酸化抗体は検出できているのですが、どうやって検出したらいいのでしょうか？
これまで、Canget signalでほぼほぼ全ての抗体は成功しています。
　

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No.10974-7 - 2022/11/22 (火) 05:00:47 - LPS

>これまで、Canget signalでほぼほぼ全ての抗体は成功しています。
質問があります
刺激なしでこれをどのように確認しましたか?

(無題)

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No.10974-6 - 2022/11/21 (月) 20:49:47 - zam

MSでリン酸化の有無を確認してはどうでしょうか。

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No.10974-5 - 2022/11/21 (月) 14:29:06 - おお

WBの面倒なところは、検出感度が示されておらず、実際はちょっとした違いで大きく検出感度が変わってきます。
それは解決するのは難しいかもしれないけど、まずは購入先や、文献を出しているグループに問い合わせてみるのが良いのかもしれません。購入先の場合は違うロットなど提供してくれる場合もありますし。

もしバックが出ないなら抗体濃度を上げるなど少し感度を上げる工夫してみて見てもいいでしょう。ブロッキングに関しては私はそんなに大きく変わらないと勝手に思っていますが、CANGETなんとかと言うのは、特許じょううほう情報などさんこうにすると、確か塩濃度をちょっと上げたり、余りWBでつかわない PEGだったっけを少し配合してたりするようで、一般的なレシピにしてみても良いのかもしれません。

(無題)

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No.10974-4 - 2022/11/21 (月) 13:41:07 - fghjkl

1. 抗体が良くない→ 別ロットもしくは他のメーカーのものを発注しましょう。

2. サンプリングのタイミングが適切でない→ 刺激後、リン酸化のピークは短時間で一過的と思いますのでそこのあたりを外すと検出が難しいかもしれません。仮に刺激が持続しててもその様になると思います。またそれぞれのリン酸化タンパク質のリン酸化のピークも同じとは限りませんので他のが検出できてるからJAKもこのタイムポイントで検出できるはずという保証はありません。文献等も元に予備実験で何点か時間をふって検討ください。

3. 操作中の脱リン酸化→ フォスファターゼインヒビターand/or 変性剤入りbuffer（SDS-sample bufferなど）を使用してタンパク質抽出。

(無題)

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No.10974-3 - 2022/11/21 (月) 09:32:22 - さと

他の論文やデータシートを見る限りでは、培養しただけの細胞で、バンドが見える細胞のはずなのですが。。。。

刺激を加えないと駄目ですかね。リン酸化抗体なので、PBSやスキムミルクは使用していません。

Can get signalより、BSAの方がいいこともありますでしょうか。

(無題)

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No.10974-2 - 2022/11/21 (月) 09:18:25 - おお

ポジコンになるものはありますか？
実はリン酸化していないので、検出されない可能性は否定できますか？

いい抗体があるとか経験による話は出来ませんけど、Jak抗体でIPしてP-jak抗体で検出するとか。ファスタグ入りSDSPAGE GELで移動度に差をつけてるとか。いくらかやりようがあるとか思いますが。

リン酸化抗体が、検出できない。

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No.10974-1 - 2022/11/21 (月) 08:08:10 - さと

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