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(無題) 削除/引用 No.10969-6 - 2022/11/21 (月) 12:39:44 - ごんべえ 妨害物質ももちろんですが、バックグラウンドを揃えてみてください。 また、厳密に言えば「直線性」である必要はないはずです（私は4 para fittingでやっています）。 例) 妨害が問題ないと考えられるcase） BSAもサンプルもRIPAで希釈 もし妨害が問題で2倍希釈すれば可能であることが判明したcase） BSA：検量線の全ての濃度でRIPA2倍希釈バックグラウンドになるように調整 サンプル：水で2倍希釈

(無題) 削除/引用 No.10969-5 - 2022/11/21 (月) 04:34:01 - やまざき 皆様 ご回答いただきありがとうございます。 希釈倍率を増やし、うまくいきそうな範囲を探ってみます。

(無題) 削除/引用 No.10969-4 - 2022/11/19 (土) 09:30:58 - zam 既にコメントにある通り、サンプル（ライセート原液）にBCAアッセイの妨害物質が存在するためだと思われます。 ライセート中の妨害物質としては、キレート性の物質のほかに、還元性の物質も考えられます。システイン、グルタチオン、NADH、NADPHなど。物質名は調べもせずには思いつくままに書いているだけですが。そもそも細胞内は還元状態ですので。 したがって、サンプルの段階希釈のポイントを多めにとって、直線に乗る希釈範囲を予め調べておくのがよいでしょう。 なお、希釈すればするほど妨害物質の影響は減少しますが、希釈による測定誤差も生じますし、なによりも検出限界を下回ることになります。濃すぎず薄すぎない程度の希釈倍率を決めておくとよいと思います。 また、サンプル数が少ないならば、x2、x4、x8の3ポイントぐらいの希釈ポイントをとってもよいと思います。 これはBradford法で総タンパク質を定量する場合にも言えます。ご存じかと思いますが、Bradford法は還元剤の影響は少ないですが、界面活性剤の影響を強く受けます。こちらもサンプルを適宜希釈して、直線に乗る範囲を予め調べておく必要があります。 ご武運を。

(無題) 削除/引用 No.10969-3 - 2022/11/19 (土) 03:57:57 - 3 1倍（吸光度0.7)のポイントが直線性のある範囲に入ってないからではないでしょうか。直線性があるのはせいぜい2倍希釈（０.5)の点あたりまでではないかなと。0点を含めて書かれている点をプロットするとそんな気がしますが。 試料を今よりも希釈して（今, 2倍希釈としているくらいをmaxな感じで)再測定されてみればたぶん難なく解決するような気がします。

(無題) 削除/引用 No.10969-2 - 2022/11/19 (土) 00:42:39 - おお The BCA assay is generally tolerant of ionic and nonionic detergents such as NP-40, Triton X-100 and denaturating agents like urea and guanidinium chloride that tend to interfere with other colorimetric protein assays such as Lowry (Table 2) [15]. However, some reagents, like ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) [17], reducing sugars [18, 19] and lipids [20], can interfere with the BCA assay. https://www.labome.com/method/Protein-Quantitation.html 細胞内でキレート効果があるものがあってもおかしくないですしね。 また、タンパクがデタージェントなどで構造がルーズになってた方が反応しやすいとも聞きます。希釈すればデタージェントのタンパクに対する相対的量が増えますし。私は低い方をとります。あるいは複数サンプルの測定なら、ODが近いものを選び計算すると思います。

BCA アッセイでサンプル濃度が希釈倍率通りにならない原因 削除/引用 No.10969-1 - 2022/11/18 (金) 22:28:12 - やまざき お世話になります。 現在BCAアッセイでマウス組織から取り出した肝臓のlysateのタンパク濃度を定量しようと考えております。 スタンダード（bsa）を2000µg/mLから0 µg/mLまで振るように サンプルも１倍希釈、２倍希釈、４倍希釈といった具合で濃度を振ってプレートリーダー(波長562nm)で定量しております。 BSAを用いた検量線はきれいに希釈倍率通りに出るのですが、サンプルの場合はそのようになりません。 具体的には吸光度が １倍希釈　0.7 、2倍希釈0.5、４倍希釈 0.3　 のようになります。 測定範囲外ということはないかと思います。 なお、BSAスタンダードは水で希釈　ブランクも水。 サンプルはRIPAバッファーで希釈し、RIPAバッファーブランクを置いてます。 RIPAバッファーは吸光度0.04程度だったので大きな影響はなさそうです。 lysateはパウダー状にした組織をRIPAバッファーに溶解させ、sonication30sec x2ののち、 13000G 5min 4℃で遠心し上清を移すことによって調製しました。 タンパク濃度が希釈倍率通りにならない理由についてなにかヒントを知っている方いらっしゃいましたら教えていただけませんか。 どうぞ宜しくお願い申し上げます。

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