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(無題) 削除/引用 No.10959-7 - 2022/11/23 (水) 03:09:50 - TY 皆様ありがとうございます。 実はMatrigelを希釈→上層→乾燥→水和のプロトコルも試したみたのですが、ゲルの凝集が起こらない代わりに、マトリゲル コートなしのいわゆるmigration assayと変わらない結果になってしまいそれもまた実験としてうまく行っているのか確信が持てない、、、という状況でした。 アドバイスいただいたようにcorningの資料にある浸潤用の資料を問い合わせてみましたので、疑問が解消されたらこちらでご報告させていただきます。ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.10959-6 - 2022/11/22 (火) 11:14:54 - まとりげる マトリゲルのinvasion assayはやったこがないので間違っている部分もあるかもしれませんが、製品説明のpdfからの情報も併せてのコメントとなります。 https://www.corning.com/media/jp/cls/documents/jp-literature/sell_sheet/corning_matrigel-matrix_cls-047.pdf マトリゲルは、高濃度でゲル化させて使用する場合と低濃度での薄層コートで使用する場合があります。後者はゼラチンコートなどに近いです。 使われているプロトコールは薄層コートのものなのでゲルはできません。 pdfのコート済みチャンバーの説明をみると8umのポアがマトリゲルで塞がれている状態となっているので、薄層コートでポアが埋まると推測されます。またこの状態で非浸潤性の細胞は移動が遮断されるとあるので、コート後にこれをネガコンにして実験をする必要があるかもしれません。 3ページ目に浸潤実験用のコーティングの資料があるとなっているので問い合わせてもみてはどうでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.10959-5 - 2022/11/22 (火) 09:59:45 - おお コートされた商品のサンプルとか手に入れば、比較して見るのも手かもしれませんね。

(無題) 削除/引用 No.10959-4 - 2022/11/22 (火) 08:58:43 - zam そうでしたか。承知いたしました。 プロトコールの著者に直接尋ねられるのがよいでしょうが、掲示板をご覧のどなたかから有益なコメントが得られるとよいですね。 ところである論文にはマトリゲルのゲル化には言及せず、Matrigelを希釈→上層→乾燥→水和とありました。これならばゲル化の有無は気にせずともよいように思いました。 ttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC8233037/ ttps://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0012160604002738 的外れのコメントならばご容赦くださいませ。

(無題) 削除/引用 No.10959-3 - 2022/11/22 (火) 06:37:38 - TY >[Re:2] zamさんは書きました : > 違っていたら申し訳ないのですが、コーニングのマトリゲルは3mg/mL以上じゃないとゲル化しないのではないでしょうか？ > > ありがとうございます。おっしゃる通りマニュアルにも3mg/ml以下ではゲル化しないとのことが書いてあるのですが、トランスウェルのメンブレンコーティングに関しては200-300μg/mLが推奨されていて、invasion assayを行なっている論文も色々と読み漁りましたが0.5mg-2mg/mL程度を使用されている方がほとんどのようで、、、場合によってはゲル化しなかった液体部分は除去してから細胞を播種するようなプロトコルも見つけましたが何が正解かわからず困惑しています。。

(無題) 削除/引用 No.10959-2 - 2022/11/17 (木) 22:06:44 - zam 違っていたら申し訳ないのですが、コーニングのマトリゲルは3mg/mL以上じゃないとゲル化しないのではないでしょうか？

Transwellのマトリゲルコートがうまくいきません 削除/引用 No.10959-1 - 2022/11/15 (火) 23:29:23 - TY Transwellのメンブレンをmatrigelでコーティングしてinvasion assayを試みています。0.25mg/mL-4.5mg/mLまで様々な濃度、volume(40μL-100μL)でコーティングを検討しましたが、corining 推奨の 0.25mg/mLでは一晩37℃でインキュベーションしてもゲル化せず、１mg/mL でもゲル化に関しては怪しいと感じました。さらにゲル化しても、細胞を含む無血清培地を加えてインキュベーションすると、最終的にメンブレン上で細胞と共に凝集してしまっているように見えます。 ４％PFAで固定後、メンブレン上側の細胞と残ったマトリゲル（レイヤー状ではなくなっています）を綿棒で除くと、一応メンブレン下側に移動した細胞を観察することはできるのですが、実験としてうまくいっているのか判断できずにいます。 インキュベーション後にマトリゲルがレイヤー状を保持できないのは細胞がECMを消化、分解したからと考えて良いのでしょうか？それともなにか改善すべき点があるのでしょうか？ ご経験のある方がいらっしゃいましたら、ご教示いただけますと幸いです。 実験は以下のように行っています。 細胞: HeLa (5X10^4/100μL/well) Transwell: corning 24well Matrigel: corning (#356231, #354230) Cultrex (#3445-010-01) Incubation time: 24H-32H 培地:マトリゲル希釈＆上部チャンバー→無血清培地、下部ウェル→10%FBS

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