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(無題) 削除/引用 No.10956-16 - 2022/11/19 (土) 09:53:09 - US 各種実験に使う予定です。 タンパク質の発現、表現型、免沈。 特に免疫沈降法は大量の細胞が必要なので、stableがあると助かります。 PTGSですか、、、なるほど。納得できます。 アクチンの20分の1くらいの発現量〈ウェスタンでの感覚〉でも、各種実験に使えますかね。

(無題) 削除/引用 No.10956-15 - 2022/11/16 (水) 20:18:41 - fgち ステーブルはどんな実験に使う予定なのですか。 もし細胞内タンパク質相互作用の解析などの場合は得られた複数クローンのタンパク質発現レベルを比較して、高発現クローンは避けたほうがいいです。

(無題) 削除/引用 No.10956-14 - 2022/11/16 (水) 18:09:10 - G25 植物や線虫なんかでよく知られた、co-suppressionという現象に似ていると思います。多コピーのtransgeneがタンデムにインテグレートされるということで生じやすい（おそらくアンチセンス鎖の転写なんかが起こりやすいから？）RNAi関連の発現抑制です。PTGS（post transcriptional gene silencing）と説明されることが多かったように記憶します。 RNAiが着目され始めたころよく論じられていましたが、その後、あまりフォローしていないので、今はどういうコンセンサスになってるのか、、、

(無題) 削除/引用 No.10956-13 - 2022/11/16 (水) 17:54:50 - AA CMVやEF1alphaなどのメジャーな強制発現プロモーターはサイレンシングされることが多い、と細胞の不死化実験をしている先生から指摘されたことがあります。 HEKなどでAAVS1遺伝子座にCMVで入れた遺伝子は安定して発現していたりするので、CMVなら必ずだめというわけでもなさそうですが、発現低下を観察しているのであればサイレンシグの可能性を考慮されたほうが良いかと思います せっかく教わった方法ということでそれで安定発現株が取れるに越したことはないとは思いますが、ヒトやマウスの細胞株であれば昨今はゲノム編集でかなり効率よくノックイン株を作れるのでそちらを試すのもありかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.10956-12 - 2022/11/16 (水) 17:13:55 - おお >[Re:11] USさんは書きました : > なるほど、、、、CMVが抑制される可能性はあまり強く考えていませんでした。 > > CMVなどのプロモーターがメチレ-ションによって抑制されると言うのが発言の低下の原因として取り上げられる事があります。薬剤を使って発現抑制を解除しようと言う試みは、メチレ-ションの阻害剤などです。効果があまり無いこともまあまあある様ですし、余計な薬剤を加えると言うこともあってあまりやられてないと思います。

(無題) 削除/引用 No.10956-11 - 2022/11/16 (水) 12:48:11 - US なるほど、、、、CMVが抑制される可能性はあまり強く考えていませんでした。 複数のコンストラクトを作成していますが、発現量が弱くても表現型が現れる可能性もありそうなので、現状のまま解析を進めるか悩ましいです。 本来ゲノムは2コピーなので、過剰発現させる意義自体があるかが重要に成りそうです。

(無題) 削除/引用 No.10956-10 - 2022/11/16 (水) 08:46:56 - lipid 既に回答が出ていますが、経験上、プロモーターが強すぎると、いわゆるサイレンシング様に発現が抑制されるのか、発現量は著しく抑制されるような感じです。 プラスミドはインテグレートされているので、発現の段階での制御がかかっていると判断していました（正確にインテグレート率など算出した訳ではありませんけど）。 薬剤でその影響を排除しようと試しても、概して発現は上がりません。 発現をオンオフできるものに変えるなど、 発現のコントロールを考えた方が早い気がします。

(無題) 削除/引用 No.10956-9 - 2022/11/16 (水) 02:35:53 - おお 原因はこれと特定しづらいですけど、インテグレートしてないプラスミドからの発現が上乗せされていた可能性もあるでしょう。とくに細胞にT antigenがはいっていてSV40Oriを含むプラスミドを導入したなら導入時には爆発的にプラスミドコピー数があがります。 一週間で細胞がどんな状態かわかりませんが、インテグレートしてないプラスミドが減っていたとしても、それまでに発現したタンパクは半減期が極端に短くなければまだ残っているかもしれません。 またインテグレートされていたとしても、培養を重ねるごとに減っていくこともあります。高発現が細胞の生理的に好ましくないような遺伝子、Endogenousからの発現がセルサイクルやその他の状況に合わせてたくみにコントロールされていて、それが乱れるためにうまく細胞が増えない場合など、想像の域を出ないかもしれませんがそういった感じで導入しても強くは発現しなくなるか、場合によってはほとんど発現しない場合もあります。 GFPは結構高発現で維持が可能だと思います。 どうしても発現量がある程度以上必要なら、クローンを拾ってみる。一過性の発言で実験できないか考えてみる。誘導性の（Tetなど）プロモーターで必要なときに発現を誘導するなど選択肢の中から良さげなものを選んでみてはどうでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.10956-8 - 2022/11/15 (火) 23:31:00 - fgち 発現が全く消えるわけではないならば（全滅するわけではないならば）、発現が高いクローンは（たぶんそのタンパク質が量が多いと細胞にとって良くないことがあるので）途中でうまく増殖できなくなりやがて死滅して、結果的に発現が低いクローンが生き残ってるということではないでしょうか。プロモーターはなんでしょうか？あまり強力過ぎないものに変えたらどうでしょうか。大腸菌と違い、哺乳動物細胞は人為的に過剰発現させたタンパク質をうまく扱うのが下手です。

(無題) 削除/引用 No.10956-7 - 2022/11/15 (火) 23:14:43 - TS プロトコールの信頼性は大丈夫なのですか。 触れられてないのでわかりませんが。 モノクローンを数取ってもダメなんでしょうか． セレクションだけでは細胞によっては1割切るかも．

(無題) 削除/引用 No.10956-6 - 2022/11/15 (火) 21:53:22 - US たくさんのご意見ありがとうございます。自分の考えとしては、アクチンと同等以上の強いシグナルが検出されるものと思っていましたが、それは、思い込みですかね。もちろん無数のファクターが影響するのはわかります。 GFPは今からトライするところです。 抗生剤の検討はしています。もう1段強くするべきでしょうかね。 いずれにせよ、セレクションがかかって、少なくとも発現量は維持されるものと思っていました。

(無題) 削除/引用 No.10956-5 - 2022/11/15 (火) 12:06:03 - G25 全く消えるわけではないが減弱する、というのは当然のことでは？ 導入されたベクターが最初からインテグレートされてるわけもなく、多コピーの遊離のベクターが入っている状態（当然発現量が多い）から始まって、増殖とともにだんだんコピー数が下がっていきながら、ベクターのごく一部がたまたまゲノムにインテグレートされるわけですよね。インテグレートされるときはタンデムに多コピー入ることが多いといいますが、入るかどうかも何コピー入るかなんてのも偶然です。またクローンごとにコピー数も異なります（だから、目的に合わせて発現の強さ（コピー数の多さ）のことなるクローンを選んだり、取り揃えたりする）。 一般的にインテグレーションやタンデム化は二重鎖切断（DSB）末端をもつDNA断片のほうが環状プラスミドよりはるかに起こりやすい（だからトランスジェニックマウスの作成では制限酵素で切断してからインジェクションする。おそらくインテグレーションはDSBに惹起される修復機構が関与するから）なんてことも言われていますけど、そのへんは考慮されているでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.10956-4 - 2022/11/15 (火) 11:46:54 - asan ゲノムにインテグレートされやすいかどうかは細胞ややり方にもよるので、具体的個別のケースで議論しないと意味ないと思います。そもそも耐性獲得したからと言って発現しないこともあるし、だからウイルスベクターを用いて安定発現株をつくるのが一般的です。

(無題) 削除/引用 No.10956-3 - 2022/11/15 (火) 11:18:52 - qq 貰ったプロトコルで使用されている細胞とあなたが使用している細胞は、同じ細胞株でしょうか？ 上手くいかないときは、コントロールのｃDNA（例えば、GFPなど）も使ってステーブルを作ってみるとよいです。 いつのまにか発現の消えた細胞で、薬剤耐性はまだ有効ということなのでしょうか？ そもそも最初っから薬剤耐性ということなのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.10956-2 - 2022/11/15 (火) 09:45:05 - fgち 抗生剤の濃度は検討されましたか。遺伝子が導入されて抗生剤耐性になったと言っても限度がありますから、処理できる量を上回る抗生剤にさらされればやはり死んでしまうと思いますが。

stableの作成がうまく行かない。 削除/引用 No.10956-1 - 2022/11/15 (火) 09:38:10 - US 他のラボからstable樹立のプロトコルをもらいましたが、stableの作成がうまく行きません。 少なくとも、一週間目までは強い発現が持続しますが、その後抗生剤でセレクションをかけ続けると、いつの間にか消えてしまいます。 彼らはウイルスを使わなくてもエレクトロポレーションで、十分と言っていました。 全く発現が、消えるわけでもありませんが、抜け落ちる原因はなんでしょうか？

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