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(無題) 削除/引用 No.10954-10 - 2022/11/16 (水) 02:58:56 - おお 凍結しておけばとりあえずはなんとかなりますね。 マシーンでサイクル終了後４度でというのはありえなくもないですが、複数の人が使っていてあなたのあとに使いたいとか言う場合もあるでしょうし、むかし４度でオーバーナイトはペルチェを消耗するからやめてくれっていうボスもいましたし。ま４度で冷蔵庫に持っていけばいい話ですけどね。４度なら一晩ぐらいがもしかしたら酵素によっては限界かもしれません。 校正機能のあるポリメラーゼではPCRに関しては削れて実害があったような感覚はあまりありませんけど（T4 DNA Polymeraseとかは結構慎重にやってた）、念のため対策をしておいたほうがいいのかもしれませんね。そういう意味ではPCR直後はクロロフォルム、エタ沈（エタノール中で保存でもかまわない）かPCR精製キットで酵素を除去するなどしてから保存というようなてがとれるかなとおもいます。

(無題) 削除/引用 No.10954-9 - 2022/11/15 (火) 22:55:24 - ∞ 最終的に配列見るなら 途中経過がどうあれそこまで致命的にはならならそうだけど 切りだすくらいのkbであればPCRもそこそこ時間かかるだろうから サイクラーRunさせて帰宅して朝一4℃から取り出せばいいんじゃない 待って凍結で終了してもまた朝に溶かして〜で手間かかるんだし

(無題) 削除/引用 No.10954-8 - 2022/11/15 (火) 16:00:50 - AA PCRの翌日につかうのであれば冷蔵庫で保管しても大丈夫というか実験には耐えると思います。 遅い時間にPCRを始めた場合なんかだと、最後の4度のまま朝を迎えることはよくありますし。 KODのMutagenesisキットとかですと、PCR後にダイレクトにDpnIを添加する事になっていますね。 なので、必ずしも無いことではないとは思います。 (個人的には私も一回精製をはさみたいですが。) あるいは、普通の制限酵素を用いたクローニングの手順についての質問で、質問文ではPCRと制限酵素処理の間の生成処理が抜けていただけなのかなと感じました。 Mutagenesisならself ligation後の形質転換までやったほうが絶対時間節約になりますし・・・

(無題) 削除/引用 No.10954-7 - 2022/11/15 (火) 14:53:26 - G25 >Mutagenesisで鋳型プラスミドをDpn1処理したいのでは？ だとしたらゲル精製必要かしら、ってところでわけわからなくなる。

(無題) 削除/引用 No.10954-6 - 2022/11/15 (火) 14:36:05 - T-2 > PCR→鋳型プラスミドを制限酵素処理 Mutagenesisで鋳型プラスミドをDpn1処理したいのでは？ PCR反応のバッファーでも機能しますから。 反応後の保存ですが、マイナス20度か80度に入れて 数日間は問題ないと思います。

(無題) 削除/引用 No.10954-5 - 2022/11/15 (火) 14:33:14 - G25 > PCR→鋳型プラスミドを制限酵素処理 ゲル切り出しだけでは不十分として、プラスミドのキャリーオーバーを軽減させるためということだろうか。 精製しないでPCR反応液に制限酵素を直接ぶっこむのかな？　そういう手抜き法があるのは知ってるけどやりたくない。「未精製の状態で置いておく」心配をするくらいなら、「未精製のまま系の異なるの反応をする」ってことに危うさを感じないだろうか。

(無題) 削除/引用 No.10954-3 - 2022/11/14 (月) 22:19:25 - G25 校正活性のある酵素でPCRした場合、すぐに精製できない時は、冷凍するか、酵素を不活性化する試薬(例えばSDSやEDTAを含んだローディングバッファ)を添加する。 校正活性(3‘ exonuclease 活性)でPCR産物が削られるので。 > PCR→鋳型プラスミドを制限酵素処理 この流れがわからない。PCRがどうして鋳型プラスミド制限酵素処理につながるのか？

(無題) 削除/引用 No.10954-2 - 2022/11/14 (月) 20:49:07 - 774R 冷凍保存しておけばまず問題はないとおもいますけど。 室温でも数時間くらいは気にしない。

未精製PCR産物の保存について 削除/引用 No.10954-1 - 2022/11/14 (月) 19:39:12 - t PCR→鋳型プラスミドを制限酵素処理→ゲル泳動→切り出し→カラムで精製という流れでPCR産物を得たいと思っています。 PCR産物を未精製の状態で置いておくのは、保管温度関係なくやはりよくないのでしょうか？今回は鋳型はプラスミドですが、それ以外のときで異なればそれも教えてください。 できれば1日でまとめて行いたいのですがまとまった時間が取れない日もあるので、どこなら中断による悪影響が少ないか教えてください。

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