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(無題) 削除/引用 No.10950-8 - 2022/11/22 (火) 02:12:27 - おお >[Re:7] G25さんは書きました : > >サーモンス（だったけ）スパームDNA > > 余談ですが、 > > 今ではsalmon sperm DNAが普通ですが、1990年代以前はHerring (ニシン） sperm DNAでした。 補足ありがとうございました。まさに実際使ったのがどっちだったかと書くときに迷ってしまいました。昔はプロトコールにsalmon sperm DNAと書かれているのに実際はHerring DNAを使えとボトルを渡されたりとかしたりもしてましたね。

(無題) 削除/引用 No.10950-7 - 2022/11/18 (金) 12:27:21 - G25 >サーモンス（だったけ）スパームDNA 余談ですが、 今ではsalmon sperm DNAが普通ですが、1990年代以前はHerring (ニシン） sperm DNAでした。昔は日本だけでなく海外でもニシンは豊富でしたし、（魚食はあまりしない印象のある）欧米でも古来、ニシンは重要な食料源で、漁獲量は多かったですから。しかも、日本でこそニシンの白子は美味として食用にされますが、海外じゃただの廃棄物ですから、安価な材料だったのでしょう。 今では、ニシンの資源量が激減して、また食材としての需要も低下しているのでしょう、人気が高く養殖も盛んなサケ類の精巣に材料がすっかり置き換わってしまいました。

(無題) 削除/引用 No.10950-6 - 2022/11/18 (金) 09:02:24 - おお とりあえず１％ぐらいのSDSとアザイドで６０度ぐらいで引っ剥がしHRPを不活性化させて、リプローブしました。 ２XPBST Tween 20 １％に １％PVPと５０ug/mlのサーモンス（だったけ）スパームDNAでブロッキングしました。DNAはハイブリするわけでもないので変性させず加えて、同様のバッファーにSA-HRPを前より５倍薄い量でプローブしました（今回五万倍希釈）。２XPBST Tween 20 １％で３回洗って最後に通常のPBSTに変えて（イメージ取るまでの乾燥を防ぐぐらいの意味とHRP反応時にメンブレンが含んでいるバッファーが極端にWBと変わらなくするため）、検出するとバックは検出に影響がないぐらい下がりました。 まあ一度検出したあとのメンブレンなので完全に結論づけがたいですが、ハイブリしたわけでもないポジティブチャージのメンブレンの場合、チャージを中和できるようなものを入れたほうが良さそうです。

(無題) 削除/引用 No.10950-5 - 2022/11/12 (土) 11:15:09 - おお >[Re:3] zamさんは書きました : > 今はどうか知りませんが、昔はデンハルト（Ficoll+PVP+BSA）とサーモンスパームDNAをSSCに混ぜ混ぜしてブロッキングに使ってました。 デンハルトはRIを使うノーザンやサザンで大昔は使ってましたね。結構高く付きそうな感じです。うちはWBではBSAより割安なPVPを使っているので、両方入れてさらにFicolですか、Ficolも結構高かったはず。それを考えるとよくそんなもの何も考えずに使っていたなぁと今更思ったりも。 SSCは最終的に１xでしょうか？サーモンスパームDNAは混ぜてたんですね。あったほうが良さそうな気がしてきました。強い負電荷に帯びたものだとあとヘパリンとかかな。。。 よくよく考えるとハイブリでビオチンラベルのプローブを使うときにはハイブリのときにスパームDNAなりtRNAなりPolyICなどを入れているだろうから、その後にSA-HRPでインキュベートするときにはその溶液や、直前のブロッキングで核酸などが入ってなくてもすでに核酸でブロッキングがかかっていると見てもいいのかもしれません。わたしはハイブリのステップはないのでポジティブチャージが露出したままっていうのが問題かなと思えてきました。 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.10950-4 - 2022/11/12 (土) 10:55:26 - おお >[Re:2] G25さんは書きました : > SA-HRPを振りかけるだけで核酸プローブの非特異的吸着をブロックするのではないので、ブロッキングに凝る必要はないようにも思うけど。普通のスキムミルクとかで。 スキムミルクは使ってみますか。強くポジにチャージしてそうなのでノンスペの原因になるかもなぁと思ったりしてました。塩濃度上げるてもあるのかもですねぇ。普段WBで使っているPVP PBSTで結構強いバックが出たので、、、デタージェントなんかもHRPが大丈夫なら色々加えてみてもいいのかなぁとも。SDSを０.１％ほど加えているのも見つけたんですけど、ちょっとそれはどうしようかと、、、 > > もしこだわるなら、核酸ブロット検出系のDIG systemの向上に力を入れていたBoehringer Mannheim/ RocheのDIG systemのBlocking reagentがいいかも。 そうなんですよねぇ、出来あいのものはよく使われている、、、

(無題) 削除/引用 No.10950-3 - 2022/11/11 (金) 14:11:01 - zam 今はどうか知りませんが、昔はデンハルト（Ficoll+PVP+BSA）とサーモンスパームDNAをSSCに混ぜ混ぜしてブロッキングに使ってました。

(無題) 削除/引用 No.10950-2 - 2022/11/11 (金) 13:58:33 - G25 SA-HRPを振りかけるだけで核酸プローブの非特異的吸着をブロックするのではないので、ブロッキングに凝る必要はないようにも思うけど。普通のスキムミルクとかで。 もしこだわるなら、核酸ブロット検出系のDIG systemの向上に力を入れていたBoehringer Mannheim/ RocheのDIG systemのBlocking reagentがいいかも。 DIG systemではpositive charged nylon membraneの使用を推奨していて、それでも効果的にワークするブロッキング剤でした。それ単独手OKで、基本、carrier DNA/RNAの添加は必要ありませんでした。 まだメルクから入手できるようですね。バカ高いけど。 https://www.sigmaaldrich.com/JP/ja/product/roche/11096176001 中身は乳カゼインなので、ちょっとグレードのいいカゼインで代替できるかも（試薬カゼインにビオチンは含まれていないと思いますけど）。

ポジナイロンメンブレンブロッキング 削除/引用 No.10950-1 - 2022/11/11 (金) 12:47:11 - おお ビオチンラベルしたDNAが、ポジナイロンメンブレンにぶろっティングされているのですが、それをストレプトアビジンHRPで検出しようと思ってます。ブロッキングは何をつかったらいいでしょうか。こういう系ってかなり昔からキット化されていて、調べてもキットのものを使ったとか、、、中身がよく分からなかったり。 プラスチャージを解消するのにtRNAとかサ-モンスパ-ムDNAとか入れた方がいいですよね、とバックグラウンドが強く出てから思った。

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