お世話になっております。
初学者のため用語の誤りや認識違い等あり、基本的な内容かと思いますが、以下ご教示いただけますと幸いです。
色々調べた結果、少し頭が混乱しているかもしれません。
培養細胞に接種したRNAウイルスについて、ウイルスゲノムコピー数の経時的増加をRT-qPCR(2ステップ、SYBR法）による絶対定量で算出したいと考えております。
RT-qPCRなので、ウイルスRNA抽出、逆転写を行ったうえでqPCRを行います。
このサンプル調整の過程で生じるサンプル間のブレは、相対定量であればリファレンス遺伝子を用いることで補正可能かと思います。
調べたところ絶対定量ではトータルRNA濃度、あるいは鋳型cDNA濃度を揃えたら良さそう？ということが分かりました。
しかし、濃度測定ではウイルス以外の培養細胞由来のRNAも含まれ、トータルRNA濃度に基づく濃度調整が、実際のウイルスRNAの増減を覆い隠さないのかが疑問です。
以下、上手く説明できないですが、私が懸念している内容です。
培養を継続するとウイルスも細胞も増えますが、増加率には差があるので、トータルRNAに占めるウイルスRNAと細胞由来RNAの比が変わる。
ウイルスRNAは増えたが、細胞由来RNAがより増えたので、トータルRNA補正によって大きく希釈される。
この希釈倍率がウイルスRNA増加を隠す可能性は無いのか？
今回のような絶対定量を行う際にはどのようにサンプル調整によるブレを補正したら良いか、というのがご教示いただきたい内容です。
また、上記の文章に理解の誤り等あればそちらも訂正していただけますと幸いです。
何卒よろしくお願い申し上げます。 |
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