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(無題) 削除/引用 No.1094-13 - 2012/11/05 (月) 02:22:21 - ふらふら ＞おお様、KY様、KEN様、名無し様 本当に色々とご提案をありがとうございます。 書いていませんでしたが、うちではWBはセミドライ式で行っています。 ブロッキング液（5% スキムミルク/TBS-T）は、その都度作っています。 みなさまのコメントを拝見させていただいて、 どこかには原因はあるのだろうなとは思いますが、やはりここで討論するのは限界があるかなと思いました。 何より、 ＞印象としては、これ以上はデーターを見ながらじゃないとサジェスチョンしにくい状態です。 このコメントをいただき、やはりそうですよねという感じです。 正直、ここで質問しても解決しない可能性が高いとは感じていたのですが、 私自身まだまだ未熟なので、もしかしたら…という思いでトピックを立てさせていただきました。 みなさまのコメントを再度読ませていただき、もう少し色々と検討し、試せそうなことは試していこうと思います。 最悪、別のタグを付けて作り直し…ということになるかもしれませんが、 うちで作製しているコンストラクトのほとんどがFLAG付きなので、なるべく避けたいところです。 色々検討し、解決したときはまた何らかの書き込みをさせていただこうかと思います。 今回は1度、ここでこのスレを終わりとさせていただきます。 （そのほか思いつくことがあれば、書き込んでいただいても全く構いません） みなさま色々と本当にありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.1094-12 - 2012/11/05 (月) 01:02:40 - 名無し flag-tag 蛋白質が発現してない（か発現レベルが非常に低い）ということはないでしょうか。もし元々その細胞にある蛋白質ならば、ウェスタンでみえてるのは内在性のものとかいうことは。flagtagだと分子量では両者の区別つかないとおもうので。トランスフェクションまでの過程をよくチェックするのはどうでしょう。 それでも改善しないなら、とくにflagでなければ困るという特別な理由がないならば、思い切ってtagの種類を変えてみるのがよいとおもいます。

(無題) 削除/引用 No.1094-11 - 2012/11/03 (土) 06:47:04 - おお WBのブロッキング液(PBST+5%ミルクなど)がコンタミでインキュベーション中にくさってくるというトラブルをおこす人がたまにいます。非常に強いシグナルを出す抗体はそれでも検出できたりしますが、、、 なのでなるべくブロッキング液はようじ調整にしてます。

(無題) 削除/引用 No.1094-10 - 2012/11/03 (土) 04:49:11 - KEN 実は、WBのFLAGの抗体希釈率を見間違えたというオチはないんでしょうか？ 私は、時々、数字の読み間違えと桁の読み間違えをやらかすので。。。 一応、ドットプロットで、確認してみるとかどうでしょう。 どうせ染まらないのですから、抗体濃度を1ケタぐいっと上げたものも試してみるとかどうですかね。。。 困ったときは、気分一新して、作れる試薬類は作りなおしてやりなおしですかね。あと、他の人にやってもらっておくとか。 どうにもこうにも駄目だったら、3ｘFLAGにしてみるとか。←全く根本解決になっていませんが。

(無題) 削除/引用 No.1094-9 - 2012/11/03 (土) 02:16:44 - KY 複数のFLAG-タンパク質が検出できない。同じ二次抗体はワークしている。トランスフェクションも問題ない。 のであれば、どこかでFLAG試薬の取り違いがあるとしか思えない。 FLAG M2抗体じゃなくて、FLAG M2 agaroseだったとか、FLAG peptideと間違えていたとか。

(無題) 削除/引用 No.1094-8 - 2012/11/03 (土) 01:02:23 - おお >[Re:7] ふらふらさんは書きました : この手のじっけんはあまり摩訶不思議なことが起きる系ではないという印象がありますけど、、、とくにFLAGとか抗体にすごい癖があるようには思わないですし(WBで)。 ほかの抗体や、ICCではうまくいっているということですが、なにか見落としてませんでしょうか?検出できていても、場合によってはできる、出来た出来なかったの白黒より、感度がどのくらいだったとか、、、チューブリンはいい抗体があるのだと思いますし、細胞に存在する量的にはかなり多いので検出感度が1/5程度でもバンバンにシグナルが出るかもしれませんし。 印象としては、これ以上はデーターを見ながらじゃないとサジェスチョンしにくい状態です。 ICCもシグナルの強さとか、ポジティブの細胞の数とか前と変わりありませんでしょうか? > ＞M2 antibodyのポジコンになるものはないのでしょうか？ > FLAG-タンパク質Aは最近作製したもので、数年前に作製し、FLAGで検出できていたFLAG-タンパク質Bやタンパク質Cをポジコンにしようとしたのですが、ダメでした。 特に前にできた系が働かなくなっているので、WBのどこかが変わってしまっていると思うのがだとうだとおもいます(もしトランスフェクションの効率が落ちたとかが原因でなければ)。流したタンパク量(少ないだけでなくおおくてもオーバーロードで変になることがある)、えいどうの具合(マーカーである程度察しがつきますが、トランスファー後にでも一度トータルを染めると様子が分かります。トランスファーの具合(これもトランスファー後の膜とゲルを染めることで様子が分かると思います)などチェックポイントはまあまああると思います。知り合いはWETのトランスファーでスポンジ(フィルターパッド)の目が詰まってきてトランスファーがうまく行かなくなったといって、セミドライに変更したひともいます。そのまえにわたしはラボを移った時にWETでやっていたらぼで、その系でやるとどうもバンドがシャープに移らないので、スポンジとかいろいろ疑った末、そのらぼにあった、昔使ってたが使わなくなったセミドライのブロッターを見つけ出してきてそれに乗り換えたことがあります。やはりスポンジが原因だったのかなぁとあとから思いおこしたりしています。 WBは非常に検出しやすい系ではベストの状態からほど遠い状態でも検出できたりしますが、そうでないものはなるべくベストの状態で検出するほうがいいですよ。 検出はフィルムを焼いていますか?

みなさまありがとうございます。 削除/引用 No.1094-7 - 2012/11/03 (土) 00:13:31 - ふらふら ＞~さま、Harmoniaさま、おおさま みなさまご相談にのっていただき、ありがとうございます。 ＞M2 antibodyのポジコンになるものはないのでしょうか？ FLAG-タンパク質Aは最近作製したもので、数年前に作製し、FLAGで検出できていたFLAG-タンパク質Bやタンパク質Cをポジコンにしようとしたのですが、ダメでした。 ＞また、当時と細胞株やプラスミドは同じなのでしょうか？ 細胞株やプラスミドも同じものを使っており、HEK293細胞でベクターもpcDNA3.1と統一してあります。 ＞・たんぱく質A、B、CのWBでは内在性のものを見ている HEK293には内在性のタンパク質A、B、Cはありません。 ＞・ICCでは非特異反応を見ている ネガコンとして、1次抗体なし（あまり正確なネガコンではないですが。）の染色や 空のpcDNA3.1をトランスフェクションした293細胞を用いましたが、FLAG抗体では染まりませんでした。 ＞２次抗体のロットが実は以前と変わっていたとか？ 変わっていないですし、FLAG抗体はマウス由来なのですが、 同じマウス由来の抗体でtubulinなどがありますが、それは問題なく検出でき、 2次抗体にも問題はないと考えています。 ＞たとえばFLAG抗体をメンブレンに段階希釈でブロットし、検出できますか？ ＞２次抗体を段階希釈でブロットし、検出できますか？ 少し検討してみます。 ＞特異的抗体がラビットとかのポリクローナルなら、2次抗体が怪しくないですか? 上記の通り、その他のタンパク質の検出に対して、今回と同じ2次抗体が反応しているので、2次抗体は問題ないかと思われます。

(無題) 削除/引用 No.1094-6 - 2012/11/02 (金) 22:44:01 - おお 特異的抗体がラビットとかのポリクローナルなら、2次抗体が怪しくないですか?めんせんではHRP標識つかってなければ、めんせんでワークするのも2じ抗体のちがいで説明可能ですし。

(無題) 削除/引用 No.1094-5 - 2012/11/02 (金) 20:44:05 - Harmonia ２次抗体のロットが実は以前と変わっていたとか？ 抗原ー１次抗体ー２次抗体ー検出試薬 のどこのリンクが切れているかをそれぞれ調べてはどうでしょう？ たとえばFLAG抗体をメンブレンに段階希釈でブロットし、検出できますか？ ２次抗体を段階希釈でブロットし、検出できますか？

(無題) 削除/引用 No.1094-4 - 2012/11/02 (金) 17:58:44 - ~ M2 antibodyのポジコンになるものはないのでしょうか？ また、当時と細胞株やプラスミドは同じなのでしょうか？ ・融合タンパク質は何らかの理由で発現していない ・たんぱく質A、B、CのWBでは内在性のものを見ている ・ICCでは非特異反応を見ている でも、書かれている結果との整合性が取れると思います。 ICCではネガコンは置かれていますか？

それもやってみたのですが・・・。 削除/引用 No.1094-3 - 2012/11/02 (金) 17:52:53 - ふらふら >KENさま お返事ありがとうございました。 確実に検出できていた時のサンプルもすでに試してみましたが、 検出できず、今は何をポジコンにしていいかもわからなくなって、 先生も含め、研究室内でも困っている次第です。 やはりかんがえられるのは試薬でしょうか・・・？ ただ気になるのですが、試薬の問題でタグの検出にだけ影響が出ることってあるのでしょうか・・・？ FLAG-タンパク質Aを発現させて、タンパク質Aの抗体では検出できるので、 タンパク質自体には影響はないということですよね？？？

(無題) 削除/引用 No.1094-2 - 2012/11/02 (金) 17:03:20 - KEN FLAGが確実に検出できていた頃のサンプルは残っていないでしょうか？ それを用いてもう一度WBをやってみてはどうでしょう？ それで検出出来なければ、試薬の問題と。。。

最近WBでFLAGが検出できません。 削除/引用 No.1094-1 - 2012/11/02 (金) 15:39:27 - ふらふら いつもお世話になっております。 あるタンパク質A（150kDa）のN端にFLAGタグを付加したFLAG-タンパク質Aを作成しました。 それをHEK293細胞に発現させ、発現の確認をWestern blotting（WB）と細胞染色（ICC）を行いました。 WBとICCに用いるFLAG抗体は同じで、Sigma のFLAG M2です。 WBに用いる時の細胞の可溶化はSDS sample bufferです。 その結果、ICCではFLAGのシグナルが検出できていたのですが、 WBだとバンドが全く検出できません。 しかし、目的のタンパク質Aに対する抗体を用いて検出をしたところ、タンパク質Aのバンドは検出できました。 タンパク質Aの抗体でバンドが見えなければ、細胞に発現していないということになるのですが、バンドが見えるので、そうとは考えられません。 またICCではFLAG抗体でシグナルが見えていますし、FLAG抗体が悪いというわけでもないと考えています。 FLAG抗体が残り少なく、新しいロットのものを購入して試したりしましたがWBでは検出できませんでした。 今回のタンパク質Aだけでなく、FLAG-タンパク質BやCのものも、タンパク質BまたはCに対する抗体では検出できるのですが、 WBでFLAG抗体での検出ができません。 1年前までは確実に検出できており、何も問題がなくその頃からその他試薬組成、手順等は変わっていないはずなのですが。 タンパク質Aに対する抗体で検出ができているものの、 やはりFLAGの検出ができないというのは、研究を進める上でかなり支障があります。 何かわかる方、考えられる点がある方はお教えいただければと思います。 よろしくお願いいたします。

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