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C2C12細胞における吸光度補正について トピック削除
No.10924-TOPIC - 2022/11/02 (水) 06:56:06 - 名無し
現在C2C12細胞を扱っており、蛍光標識でとある物質の量を定量することを検討しております。
その定量にあたって、得られた吸光度を細胞数またはタンパク質量で補正しようと思うのですが、いかんせんサンプル数が多く(11個のサンプルをn=4で44well分あり、時間を6〜48hで振るため合計176well)、すべてのウェルで補正をするとなると非常に大変です。

この場合、播種するウェルの適切なサイズと、すべてのウェルにおいて補正をかけるための実験をする必要があるかご意見をいただきたいです。

現在ウェルは24wellを予定していますが、もし補正を行うための細胞回収などが96wellでも可能であれば、手間や添加試薬を節約できる観点から96wellにしたいとも考えております。
 
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(無題) 削除/引用
No.10924-4 - 2022/11/02 (水) 08:07:04 - zam
> 細胞数またはタンパク質量で補正しようと思うのですが、
> すべてのウェルにおいて補正をかけるための実験をする必要があるか

トピ主さんの実験目的によりますから、第三者としては何とも申し上げられませんが、とりあえず思いついたことを書きますと。

もしコントロール群の細胞数(またはタンパク質量)がわかればよいということであれば、全ウェルの細胞数(またはタンパク質量)の測定は不要ということになりますね。


細胞数を揃えて播種したのであれば、細胞数で補正する必要はないと考えます。
しかし、実験の性質上、ウェル間で細胞数が大きくバラつき、かつ、そのバラツキによって蛍光物質の測定結果が違ってくるのであれば、補正は必要と考えます。
たとえばあるサンプルは細胞を死滅させてしまい、そのため見かけ上、蛍光値が他のサンプルと大きく異なってしまい、実験結果の解釈が難しくなる、というような。


ハイスループットで細胞数を測定する手段(機器+試薬)がありますので、購入するなり借りるなりしてみてはいかがでしょうか。

言わずもがなですが、マルチチャンネルピペットがあれば、スループットは向上します。

(無題) 削除/引用
No.10924-3 - 2022/11/02 (水) 07:27:24 - おお
https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/62249
Hoechst 33342とかじゃだめか?33258よりも膜透過性に優れるので、適切な濃度加えて30分ぐらい置いといたらDNA-Hoechst複合体の蛍光がでるのでそれを測ればいい。

そのた蛍光色素は色々出ているので検索してみるといいかと。物によっては死んだものとか膜を壊さないとDNAにアクセスできないようなものもあるけど、そういう場合でもジギトニンとか存在下で添加してやれはDNAの相対量は傾向で測れる。

(無題) 削除/引用
No.10924-2 - 2022/11/02 (水) 07:27:22 - qq
答えになっていませんが、、、

>得られた吸光度を細胞数またはタンパク質量で補正しようと思うのですが、
で、どっちで補正するおつもりでっしょうか?
ウェルあたりで補正するのではだめなのでしょうね?(それを聞いているということでしょうか?)
ウェルあたりで考えるのであれば、11群ではなく、4群以下に実験デザインを変えるほうが良いのではないかと思います。

タンパク質で補正するのであれば、血清の持ち込みが大きな変動要因になるような気がします。
細胞数を計測するのであれば、トリプシンで剥がすのでしょうか?
C2C12を使うのだから、分化後も対象にしていると思いますが、多核の細胞も適切に細胞数を計測できるのでしょうか?

C2C12細胞における吸光度補正について 削除/引用
No.10924-1 - 2022/11/02 (水) 06:56:06 - 名無し
現在C2C12細胞を扱っており、蛍光標識でとある物質の量を定量することを検討しております。
その定量にあたって、得られた吸光度を細胞数またはタンパク質量で補正しようと思うのですが、いかんせんサンプル数が多く(11個のサンプルをn=4で44well分あり、時間を6〜48hで振るため合計176well)、すべてのウェルで補正をするとなると非常に大変です。

この場合、播種するウェルの適切なサイズと、すべてのウェルにおいて補正をかけるための実験をする必要があるかご意見をいただきたいです。

現在ウェルは24wellを予定していますが、もし補正を行うための細胞回収などが96wellでも可能であれば、手間や添加試薬を節約できる観点から96wellにしたいとも考えております。

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