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(無題) 削除/引用 No.10920-18 - 2022/11/04 (金) 14:59:58 - おお まず、カラムを通す時通りすぎて、カラムにつかなかったフラクションぐらいは取っておくといいでしょう。素通りしてたらそこにあるはずですし原因究明にも役立ちます。何かconstruction(プラスミドを作る)しているなら、それぞれ配列によって作りやすい、にくいがありますから難しいconstructionの時はバックグラウンドが目立ってハズレばかりでそれが原因でミニプレップが上手くいかなく感じる場合もあるかもしれません。究極的にはミニプレップは、昔からあるアルカリLysis方や、ボイル法でやってしまえばキットがどうなのかとか、変になったとか言うことは考えずに済みます。 コンピテント作る時は、シングルクローンを拾ってから増やしてますか、そうせずに増やしたりした場合何か異質な物が少しずつ増えて来ている場合があります。それがクローンとして増えて来たためDNAが取れないとか。STBL2はストレプトマイシン耐性なので、もし使ってなければ使っておいても良いかもしれません。 本当に難しいconstructionはPCRでポジのクローンができたなら、そのクローンをもう一度 ストリーキングして完璧に純化した状態で液体培地に移さないとプラスミドが取れないとかいうこともあります。

(無題) 削除/引用 No.10920-17 - 2022/11/03 (木) 21:48:15 - MIDI MIDIレベルだと同じ50mL液量を処理して濃度が100〜3000ng/uL くらいブレるからなにかしらの要因で収量差はあるんだろうな とは思いつつ予備を仕込んだりエタ沈で目的の濃度にしてしまうので ごり押しのまま次に進んでる・・・ 濁度を測定して合わせてるわけでもなし そもそもKitに細胞濃度まで記載してるわけでもないから 見た目でペレット量決めてるズボラが悪いんだけど。 溶菌や中和の時間が厳密であるならMIDI10本やれば 数mLを複数本入れてる間に時間が経つから 最初と最後で収量にバイアスかかりそうなもんだけど 取れる時は取れるし、取れなかったLotと同じコロニーから 再度培養して同じ手法でやってみたら普通に取れたり いまいち傾向がつかめてない。

(無題) 削除/引用 No.10920-16 - 2022/11/03 (木) 18:50:57 - 桜井 MM294からstbl2に変えたら一回ちゃんととれたんですが、その次別のプラスミドでstbl2でやったらまた失敗しました(涙) キットが決定的におかしいわけではないということは分かりましたが、別のポイントで何か問題が生じているようです うまくいったときといかなかったときで何が違ったのかもう少し考えてみます… ただ単に疲れていて凡ミスしてるだけかもしれません。。。

(無題) 削除/引用 No.10920-15 - 2022/11/03 (木) 02:21:30 - おお ちなみにE Coliの株を変えたのですか、それともロットとか自作なら違うときに作成したものとか。。。 後学のためにコメント頂けますか？ といっても株を変えて収率が劇的に変わるんだろうか。。。HB101とか使ってるとか？

(無題) 削除/引用 No.10920-14 - 2022/11/02 (水) 20:59:23 - 桜井 みなさん、たくさんのアドバイスありがとうございます。 コンピを変えたら状況が改善したため、おそらくこれが原因だろうと安堵したところです。 今回のように収量ゼロみたいなことは初めてだったのですが、私は昔からミニプレップの収量が低い傾向にありました。私も中和のステップをおそるおそるやっており、ここは素早くやっていいというのは初めて知って勉強になりました。今度からそうします。

(無題) 削除/引用 No.10920-13 - 2022/11/02 (水) 10:55:02 - むぎ すみません！溶出はmp6です。書き間違えました。

(無題) 削除/引用 No.10920-12 - 2022/11/02 (水) 10:52:53 - むぎ こんにちは。 質問者様の状況と違っていたらすみません。 私も数年前、日本ジェネティクスのキットにおまけで付いていたLBカプセルを使っていた時に、プラスミド収量が急に低下した経験があります。その時は50ul のmp5で溶出して、DNA濃度が5~20ng/ulほどでした。 mp5を新しく作り直しても改善せず。 薬剤セレクションが甘くて、プラスミドを持っていない大腸菌が混ざっていることを疑い、アンピシリンを作り直したり、寒天培地にストリークしてシングルコロニーから増やし直しても収量は変わらず。 一方で、自作のLBを使っているラボの他のメンバーは、全く問題なくプラスミドが取れていました。 そうこうしているうちに、おまけのLBカプセルをLB寒天培地作成で使い切ってしまったので、試薬から新しくLBを調整したところ、途端に収量が回復しました（50ul のmp5で溶出して、DNA濃度が250~350ng/ul）。 LBカプセルがなくなってしまったので比較はできなかったのですが、それ以降おまけのLBカプセルは寒天培地作りに使うようにしました。そのあとはトラブルが起きていないです。

(無題) 削除/引用 No.10920-11 - 2022/11/02 (水) 09:52:28 - おお >[Re:7] 九院さんは書きました : > ちょっと前に話題になっていたのですが、こんな可能性はないでしょうか。 > カプセル状のLBが問題かもしれないとのことです。 > > ttps://twitter.com/torusengoku/status/1495279665422151688 カプセル錠LBもカラムも随分昔からありますが、この手のトラブルは初耳ですねえ。経験のある方いるのでしょうか。いまいちツイッターでは因果関係がわからない。

(無題) 削除/引用 No.10920-10 - 2022/11/02 (水) 09:48:26 - ああ 以前、私もキットを変えていないのにmidiプレップ操作で極端に収率が下がったことがありました。その際にあれこれ試したのですが、明らかになった結論は「中和の仕方がまずかった」でした。 アルカリ化する際にはゲノムDNAがちぎれないように優しく溶液を混ぜると思いますが、無知だった私は、その流れで、次の中和のステップもできるだけ優しく優しく、ゆっくりと混ぜていました。これが失敗の原因でした。 溶液がゆっくりと中和されてしまうとどうやら上手くプラスミドとゲノムDNAが分離できないようで、最終的に極端に収量が下がってしまいました。 いつもは中和して遠心後に壁にべたっとつくペレットが、上手くいかなかったときには、底に沈んで砂のようにサラサラになっていました。 優しく行うのはあくまでアルカリ化のステップで、中和は「急速に」行わなければだめです。 中和液を入れて蓋を閉めたら、手早くしゃかしゃかと振って均一に混ぜる、という動作をしたら、それだけで劇的に収量が改善しました。

(無題) 削除/引用 No.10920-9 - 2022/11/02 (水) 09:04:55 - zam 「70%」エターノルが70%でなかったという件ですね。あるあるです。

(無題) 削除/引用 No.10920-8 - 2022/11/02 (水) 08:59:01 - TS そこなんですよね。 もう数年も前なんで正確に覚えてないんです。 たぶんキットの使用途中から調子悪くなった気がしたんですけど、 ミニプレップの溶液とかは、前のキットの残りとか使ったりもしてたし、 正確にわからないんです。 まぁなんで、さっきも書きましたが学生が原因かなぁと思っていたのですが、同じようなトピがあったので参考までに。

(無題) 削除/引用 No.10920-7 - 2022/11/02 (水) 08:58:36 - 九院 ちょっと前に話題になっていたのですが、こんな可能性はないでしょうか。 カプセル状のLBが問題かもしれないとのことです。 ttps://twitter.com/torusengoku/status/1495279665422151688

(無題) 削除/引用 No.10920-6 - 2022/11/02 (水) 02:53:01 - おお ちなみにそのキットで異常があると感じたとき以前で同じロット（溶液などが一つのボトルから使っている）でうまく言ってたのですか？新しく買ったのですか？共通した試薬でうまくいく場合と行かない場合があるなら、キットの問題と判断するのはよほどのことがない限り難しいと思いますが。

(無題) 削除/引用 No.10920-5 - 2022/11/01 (火) 20:01:44 - TS あ、わたしも数年前に日本ジェネティクスのキットでプラスミドが取れなくなりました（収量が異常に低い）。 それ以来、サイトローブのキットを使っています。 実際、こっちの方が安いし、今のところトラブルありません。 http://www.scitrove.co.jp/rbc/YPD.html 結局原因はわからず、学生が試薬になんか変なことしたのかなと思ってましたが、実際はどうか。

(無題) 削除/引用 No.10920-4 - 2022/11/01 (火) 19:06:41 - zam 原因がキット自体の問題なのか、外れロットのせいなのか、保存中にへまをしたのか、大腸菌が悪いのか、プレートが悪いのか、LB+Gmの培養が悪いのか、PCRなのか、ミニプレップの手技の問題なのか、遠心機が壊れているからなのか、電気泳動やUV測定の問題なのか。はたまた別のことなのか。 こういう問題に限りませんが、ひとつひとつ疑わしいことを確認して潰していくことです。 ご指摘の通り、確実にプラスミドDNAが取れるはずの大腸菌があるなら（たとえばグリセロールストックしておいた形質転換体を培養してみるとか）、そいつでミニプレップしてみるとか。 また、もしキットに不安があるなら、メーカーに問い合わるべきでしょう。もしかしたら、過去に同様の問い合わせがあって、何かアドバイスをもらえるかもしれません。あるいは、ひょっとしたら、不良ロットだったのかもしれませんし。 Nippon Geneticsのキットは使ったことがないのでわかりませんが、度のメーカーも似たり寄ったりだと思います。 溶解液（mP2に相当）や中和液（mP3）のpHを確認するとか。誰かが誤操作してキットの溶液をダメにしてしまっていたとか。溶出液が違っていたとか。使用前の温度は適切かとか。 PCRに関しては、プラスミドDNAで汚染されたピペットを（除染せずに）使用したために、そいつが誤って増えてしまっていたものを見ていたとか。ならば、いちど除染してはどうでしょうか。 また、可能ならばフィルターチップを使うという手もあります。 他の方も指摘するように、コロニーPCRの限界もありますので、過信しないことです。 他には、 ・ゲンタマイシンを別ロットに変える。 ・ゲンタマイシンをカナマイシンに変える。 ・あるいは、いっそのこと、薬剤耐性マーカーから変えてアンピシリンを使うとか。 通常カナマイ系のほうが、アンピシリンよりも切れが良いですが、それでもコロニーを突いたけれど、カナマイ入り培地で増えないこともあるにはあるので。

(無題) 削除/引用 No.10920-3 - 2022/11/01 (火) 17:08:09 - おお キットを疑うのだったら、インタクトなプラスミドを形質転換したりして、確認して結論が出る様にしないと、何をやっても上手くいかないという羽目になる。そんなで、キットをを代わる代わる購入したりしてしまいに全て上手くいかずキレてしまう様な人がたまにいる。 >最近うまくいかないときは白い凝集物から細かい断片が生じ、わーっと広がる感じです。 もしかしたらイ—ストでもひろったのかな。 因みにコロ二—PCRは私は信用していません。例えば、TFで最初は複数個のプラスミド大腸菌にはいり、そのひとつが目的のプラスミドだったとします。しかし他のプラスミドが増殖につれてドミナントになれば、PCRではかかるが、コロ二—全体では違うプラスミドを保有していることになる。 また、プライマーの設定によってはG25さんの指摘している様なことも起こりうる。

(無題) 削除/引用 No.10920-2 - 2022/11/01 (火) 15:32:24 - G25 >ダイレクトPCRではちゃんとプラスミドが入っているようなので、 PCRによるチェックだと、しばしば偽陽性がでるので要注意です。 プレーティングのときに一緒に塗りたくられるligation反応液に存在するDNAが鋳型になるのが主な原因です。 プライマーはインサートでなくベクター側に設定されていますか。 キットが疑わしいのなら、キットなしでalkali SDS法（フェノール抽出の必要せずアルコール沈殿）あるいはボイル法でやってみてプラスミドがとれるかどうか見てみたらどうでしょう（たぶんそれでもプラスミドは取れてこないのではないかと私は予想します）。 実はプラスミドは入っていない宿主細菌、あるいは、それどころか宿主細菌でないなにかを拾って増やしているのかも。そんなときに、 >最近うまくいかないときは白い凝集物から細かい断片が生じ、わーっと広がる感じです。その後沈殿させた際も、昔はチューブの側面にひっついていたのですが、今は底よりにくっついている感じがします。 みたいなことありました。

ミニプレップの失敗について 削除/引用 No.10920-1 - 2022/11/01 (火) 14:54:14 - 桜井 プラスミドをトランスフォーメーションした大腸菌をゲンタマイシン耐性のプレートに撒き、出たコロニーをつついてダイレクトPCRでインサートが入っていることを確認し、2ml LB+Gm、37℃でつついたコロニーを一晩振ったあと、Nippon Geneticsのミニプレップのキットでプラスミド精製を行いました。 この際、最近立て続けにプラスミドを得られないことが続き、何故だろうと悩んでいます キット内の試薬自体は変えておらず、最近新たなコンピを作ったのでそれを一番の容疑者と考えて作り直そうとしています。しかし、ダイレクトPCRではちゃんとプラスミドが入っているようなので、キットに問題があるような気もします。 また、ミニプレップの途中に違和感を感じるステップがあります。いつもはmP3を加えた際にねとっとしたモヤモヤが生じるのですが、最近うまくいかないときは白い凝集物から細かい断片が生じ、わーっと広がる感じです。その後沈殿させた際も、昔はチューブの側面にひっついていたのですが、今は底よりにくっついている感じがします。 菌量が過剰なのかなと考え、減らしてやってみてもうまくいきません。 抽象的な表現ばかりで申し訳ないのですが、何が起きているのか思い当たる方はいらっしゃるでしょうか

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