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sybr greenで定量 トピック削除
No.10916-TOPIC - 2022/11/01 (火) 03:10:40 - おお
sybr greenの検出感度は２０pgぐらいまで検出できるとされています。この感度であればPCRのexponentialのレンジで検出が可能と思われます。したがって数倍の差の定量ならPCR産物をゲルに流して蛍光強度で定量してもいいような気がします。また差がそれ以上あったとしてもSemiquantificationであれば十分対応できますし、RTqPCRしていて絶対、相対定量をしている人でも何倍になったという数値を正確に示したいわけでもないような気がします。

比較、定量はqPCRでやらなければならないという空気が充満しているように思いますが皆さんどう思いますか？
　
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No.10916-8 - 2022/11/02 (水) 14:23:29 - G25
サイクル数を調整するんじゃなくて、サンプルの希釈列でやるのがいいんじゃないかな。

サンプルの希釈列を中程度のサイクル数で endpoint PCRして泳動、バンド強度の検量線を作って飽和していない範囲を見て、比較するサンプル同士で強度が同じになる希釈率からサンプル間の標的RNAの相対量比を見積もる。これだと相対定量だけど、competitive PCRによる絶対定量でも同じようなことをしていた。

(無題) 削除/引用
No.10916-7 - 2022/11/02 (水) 14:22:23 - G25
qPCRはPCRを利用してquantificationする手法という意味で、別にリアルタイムPCRだけがqPCRというわけじゃないですけど。古くはendo-point PCRで、バンド強度による半定量もそうだし、competitive PCRによる絶対定量はreliableなqPCRの手法として認められていました。

「qPCRしろ」と言われても、私は必ずしもrealtime PCRでなくてもいいと考えちゃいます。

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No.10916-5 - 2022/11/02 (水) 12:35:23 - 777
reviwerにqPCRしろと言われてからは、qPCRでなければという空気を感じています。
モノによるってことでしょうか。

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No.10916-4 - 2022/11/02 (水) 01:20:34 - おお
ありがとうございました、簡便という事ですね。べつにqPCRでなければという空気を感じているわけでもないのですね。

(無題) 削除/引用
No.10916-3 - 2022/11/01 (火) 19:25:58 - zam
>[Re:1] おおさんは書きました :
比較、定量はqPCRでやらなければならないという空気が充満しているように思いますが皆さんどう思いますか？

必ずしもqPCRでなければという空気は感じておりませんが、どうなのでしょうね。

ご提案の方法については、私もseventhさんと同意見です。予備検討するのが気持ち的に敬遠したいです。
qPCRに慣れてしまうとPCR後のキャップを開けるのさえ、面倒なときもあります（ものぐさですみません）。

慣れ、の問題かもしれませんが。

機械も試薬もなかったときは、ちまちま半定量していましたが、今はもう、機械も試訳も買ってありますし、ポジコンのプライマーセットもいろいろ揃えている、あまり考えずにとりあえずqPCRをしているのが正直なところです。割と金があるラボなので贅沢言ってます。

(無題) 削除/引用
No.10916-2 - 2022/11/01 (火) 09:54:34 - seventh
サイクル数を調整する半定量qPCR自体が面倒くさいので、例えPCR反応終了後にチューブ内のPCRプロダクト量を直接定量できたとしてもqPCRがあればそちらを使うと思います。

ある程度立ち上がり付近のサイクルに合わせないといけないので、予備実験も必要ですし。

sybr greenで定量 削除/引用
No.10916-1 - 2022/11/01 (火) 03:10:40 - おお
sybr greenの検出感度は２０pgぐらいまで検出できるとされています。この感度であればPCRのexponentialのレンジで検出が可能と思われます。したがって数倍の差の定量ならPCR産物をゲルに流して蛍光強度で定量してもいいような気がします。また差がそれ以上あったとしてもSemiquantificationであれば十分対応できますし、RTqPCRしていて絶対、相対定量をしている人でも何倍になったという数値を正確に示したいわけでもないような気がします。

比較、定量はqPCRでやらなければならないという空気が充満しているように思いますが皆さんどう思いますか？
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