>[Re:1] USさんは書きました :
> inputのうち何割がベイトに結合して、何割が上清にあるかが正確に分かるようにローディングするべきなのでしょうか。
> あるいは、結合していることが分かるようにビーズフラクションは大量に流すべきでしょうか？
>[Re:6] USさんは書きました :
> つまり視覚的に割合を、判別する必要はないから、各々流せるだけ、流したらいいということですね？
なんだか伝わってるんだかつたわってないんだか。。。
視覚的に割合を判別して、何割がベイトに結合して、何割が上清にあるかが正確に分かるようにローディングするつもりだったんですか？それで正確に何がわかるのですか？
プロトコールでポピュラーなのは５０から１００ulで抗原をビーズから剥がすというもので、それぐらいの容量だと全部は流せないでしょう。一割から二割です。であなたの仰っている大量はどの程度なんですか？無理せず流せる上限ですか、それとも無理してでも流すことを言っているのですか？
ビーズを洗ったあと完全に水分が除ける訳ではないので、それを考慮すると（ビーズの量や種類によるでしょうけど）１００ulぐらいのボリュームで溶出するとビーズに含まれる水分量はなるべく誤差の範囲に抑えられてある程度正確にどれくらい結合したかなど見積もりやすくなるということだと思います。
また、サンプルバッファーなどを１０ul位入れてボイルしてそのまま全部流すという手もあるにはあります。全部流すのだから定量的な計算は成り立ちます。ただし場合によってはバックグランドが上がることもあるようです。
結合が見れるようにといいますが、１０％使っても結合が見れる場合も結構ありますから大量に流すというのが解決策とまでは言えないと思います。
あとは実験の目的をよく考え、同じようなIPをやっている研究があるならそういう論文やThesis（こっちのほうが方法論的には多分詳しい）をみて、プロトコールも成書に載っているものを読んで（Current protocols, Molecular biology などなど）方針を決めなさい。それでも方針を決められないなら予備的な実験をしてどれがベターか判断すればいいでしょう。 |
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