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(無題) 削除/引用 No.10910-11 - 2022/11/05 (土) 20:31:28 - toto 私も8M ureaが一番効果的と思いますが、膜貫通蛋白にはそれでもダメなものも結構あります。他の手としては、アプライする時のSDS溶液のバッファーをtris-baseだけにして、pHをHClであわせずにアルカリにしてやると溶けることがありました。 ただ、どうやってもダメな場合もあります。そのときは仕方ないので、泳動をあきらめてゲルに流さずにPVDFにスポットしてドットブロットで定量というのが最後の方法でしょうか。そのシグナルがものかどうかはしっかりコントロールをとるしかないですが。

(無題) 削除/引用 No.10910-10 - 2022/11/05 (土) 20:11:14 - 1 これはあまり褒められた方法ではないのですが、最終手段としてチップ式超音波装置による破砕があります。これ自体がタンパク質を溶かすということではなくて、SDSなどがタンパク質を溶かすのを助けるみたいな感じです。沈殿が微細な粒子状になるので、大きな塊の時と比べて、それだけ速やかにSDSにさらされる表面が多くなるみたいなイメージです。実際、難溶性沈殿物が（やらない時と比べて）溶けやすくはなります。 超音波処理のマイナス面として発熱しやすい、（試料がSDSを含む場合）泡が立つ、たまに高分子量タンパク質でペプチドの切断が起こることがある、活性酸素が生じる、音がうるさい、などです。 沈殿と上清をわけて上だけ使うのは、この時点で実験者自身でセレクションかける恐れがあるのですすめません。上と下で全く同じものかどうかわからないので。

(無題) 削除/引用 No.10910-9 - 2022/11/01 (火) 05:24:37 - おお >[Re:8] あのさんは書きました : > 凝集しているのでしょう。 > > > 既に書かれた対策の他にも、遠心して、上澄のみ泳動するというのもあります。 わたしはこれには同意できないです。過剰発現などでタグを利用して発現していることを確認するぐらいならあり得ると思いますが。また場合によって近傍のポリペプチドとアグって全体としては可溶化しているけどアグったまま泳動されるので高分子に検出されることも少なくないです。ホモダイマーで二倍の分子量の位置に来てしまうとか。また今回のケースではわざと大量に流すことでかろうじて検出できているようです。これも好ましくない理由です。 すでにボイルしてアグったサンプルがあるなら、当量の飽和尿素１０ー１２Mを加えて室温で数分間静置してから流すといいでしょう。尿素を加えてから加温すると好まなれない反応が起こります。その他の私が知っている方法はすでに指摘があるサンプルバッファー添加ご高温でボイルしないことです。あとゲルに尿素を入れるような方法もあるにはあります。 タンパク量はどれくらいでしょうかね。たまにすごい濃いタンパク濃度にサンプルバッファー入れてボイルするとほとんどのタンパクが熱変性で沈殿してしまったっていうケースに遭遇したことがあります。だいたいLysateで１から２ug/ulが適切かなと思います。１gのタンパクに大体１.４から１.７gのSDSがつくと見積もられています。これを元にどれくらいのタンパク量が妥当か計算してみるといいでしょう。

(無題) 削除/引用 No.10910-8 - 2022/10/30 (日) 23:41:42 - あの 凝集しているのでしょう。 既に書かれた対策の他にも、遠心して、上澄のみ泳動するというのもあります。

(無題) 削除/引用 No.10910-7 - 2022/10/30 (日) 21:58:12 - G25 それでも溶け残る、凝集が残る場合、私はやったことないけど、サンプルバッファに尿素(〜8 M)を加えるという方法もある。高濃度尿素ならプロテアーゼも防げるだろう。

(無題) 削除/引用 No.10910-6 - 2022/10/30 (日) 21:38:46 - G25 入れた方が安心ですね。 SH剤はプロテアーゼ阻害剤にはならんでしょう。

(無題) 削除/引用 No.10910-5 - 2022/10/30 (日) 21:13:42 - エラゴン なるほど ありがとうございます。 あと、protease inhibitorは入れた方がよいのでしょうか ライムリーのサンプルバッファー中に2-meを入れているので個人的には不要かなと思うのですが...

(無題) 削除/引用 No.10910-4 - 2022/10/30 (日) 21:00:51 - G25 室温、37℃、50℃とかで一晩とか、 過去トピでも何度か取り上げられているし、ネット上でもさまざまな流儀が見つかると思います。

(無題) 削除/引用 No.10910-3 - 2022/10/30 (日) 20:51:18 - エラゴン 膜貫通たんぱくです 貴重なご意見ありがとうございます。 なるほど そうなんですね 温和な条件とはどんな感じですか？

(無題) 削除/引用 No.10910-2 - 2022/10/30 (日) 19:07:40 - G25 細胞質性タンパク質、核タンパク質、膜タンパク質、分泌タンパク質　etc…. タンパク質の種別はどんなのでしょう？ 膜タンパク質の膜貫通ドメインのような疎水性ドメインがあると、定法に従ってサンプルバッファ中でボイルすると疏水結合で凝集してそんな結果になります。室温や温和な加温で時間をかけてSDS化するといいです。

タンパク質が解けません 削除/引用 No.10910-1 - 2022/10/30 (日) 18:30:52 - エラゴン 強制発現したタンパク質を検出しようとウェスタンを行うとタンパク質が解けずに分離ゲルの上にスタックしてしまいます。 たくさん流せば、正しい分子量に見えるタンパク質がわずかにあるのですが、 定量したいので、できれば全部溶けてほしいです。 ラエムリーのサンプルバッファーで溶かしているのですが... 皆さんのお知恵をお借りしたいです。

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