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ムギ類DNA抽出におけるプロKの使用について トピック削除
No.10909-TOPIC - 2022/10/30 (日) 18:03:06 - なな子
M1の女子です。実験初心者です。質問をお願いします。
過去のトピックを検索しましたが見つけられませんでした。

現在、ムギ類から簡易抽出でDNAを抽出しPCRでの多型判別を予定しています。

ドラフトが無いため、有機溶剤やイソプロを使用しない方法を探しています。
植物ではプロKを使うプロトコルが見つかりませんでした。動物や細胞はあります。植物はプロKを使わないものなのでしょうか？

プロトコールの一例です。どうでしょうか。

植物を粉末にしてSDSなどを含む抽出バッファーにプロKを加えてボルテックス
↓
95度10分（プロKの失活）
↓
遠心後、上清を酢酸カリウムに入れる
↓
エタ沈
↓
TEを加えてRNaseを加える
↓
65℃で30分
↓
上清を鋳型とする

皆さんお忙しい所すみませんが宜しくお願いいたします。
　
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(無題) 削除/引用
No.10909-4 - 2022/10/30 (日) 21:58:52 - なな子
おお様
論文をありがとうございます。ご紹介頂いた論文を拝見しました。上清を移すだけの簡単な抽出方法でオオムギでできるか試してみようかと思います。
イソプロ沈の方が優れているんですね。迷いどころです。
コラーゲンなど動物組織はタンパク質が多いんですね。

G25様
仰る通りです。オオムギ葉は食用になってるくらいですからポリフェノールや繊維質が豊富です。炭水化物もです。
Chelex 100 のご紹介をありがとうございます。検討してみます。
ジェノタイピングの量は多いです。できるだけ簡便にしたいところです。
実験がこんなに手間と時間のかかるものとは思っておりませんでした。皆さん大変な思いをされてきたのではと想像しております。

(無題) 削除/引用
No.10909-3 - 2022/10/30 (日) 20:56:37 - G25
動物細胞の場合、タンパク質を分解することは効果的だろうけれど、
植物の場合、タンパク質以上に植物繊維だとか種子の場合、炭水化物とかのほうが豊富でやっかいなんじゃないか？　あと、PCRを強く阻害するポリフェノール類とか。
ProKが効果的なようには思えない。硬いタンパク質の塊みたいなマウステールなんかになら必須みたいなものだけど。

genotypeingのためのPCR程度のことにフェノール抽出だのアルコール沈殿だの、液の除去や移し替え、遠心など面倒くさいことはなるべく避けたい。genotypingは多サンプルをこなさなきゃならないことが多いののでスループットを良くするためにも。

軟組織や細胞だとChelex 100 (Instagne)を使う方法なんかいいと思います。
マウステールのような硬組織や植物に適用するには一工夫必要なようだけれど、
実例はあるようだ。
https://www.researchgate.net/publication/226417465_Rapid_and_simple_method_for_DNA_extraction_from_plant_and_algal_species_suitable_for_PCR_amplification_using_a_chelating_resin_Chelex_100
基本的にはChelex 100 のスラリーにサンプル片を入れて、ボイルして上澄みをPCRに投入するだけ。Chelexが阻害物質を吸収してPCR-readyなlysateにしてくれる。
ボイルだけでlysisしないサンプルはホモジナイズなどひと手間が必要。

(無題) 削除/引用
No.10909-2 - 2022/10/30 (日) 19:09:42 - おお
www.future-science.com/doi/full/10.2144/000114286
shigen.nig.ac.jp/ewis/article/html/118/article.html
www.future-science.com/doi/pdf/10.2144/03344rr04
動物組織はコラ-ゲンなど豊富ですしね。植物の場合pkどの程度効果的かよくわかりません。
また、イソプロ沈殿はエタノール沈殿で代用できます。ただし、タンパクの持ち込みと言う点では、イソプロの方が優れている。

イソプロはドラフトで扱わないといけませんか？そこまで影響があるものと思えませんが。

上記のURLの様にマイルドな界面活性剤存在下でアルカリ抽出して中和する方法もポピュラーみたいです。PCR MIX にはPVPを加えてPCR阻害物質が中和できるようにするほうが良さそうです。

ムギ類DNA抽出におけるプロKの使用について 削除/引用
No.10909-1 - 2022/10/30 (日) 18:03:06 - なな子
M1の女子です。実験初心者です。質問をお願いします。
過去のトピックを検索しましたが見つけられませんでした。

現在、ムギ類から簡易抽出でDNAを抽出しPCRでの多型判別を予定しています。

ドラフトが無いため、有機溶剤やイソプロを使用しない方法を探しています。
植物ではプロKを使うプロトコルが見つかりませんでした。動物や細胞はあります。植物はプロKを使わないものなのでしょうか？

プロトコールの一例です。どうでしょうか。

植物を粉末にしてSDSなどを含む抽出バッファーにプロKを加えてボルテックス
↓
95度10分（プロKの失活）
↓
遠心後、上清を酢酸カリウムに入れる
↓
エタ沈
↓
TEを加えてRNaseを加える
↓
65℃で30分
↓
上清を鋳型とする

皆さんお忙しい所すみませんが宜しくお願いいたします。
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