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(無題) 削除/引用 No.10895-4 - 2022/10/26 (水) 04:53:35 - おお 繰り返しになりますが、 まあ一回ぐらいであればポピュレーションとしてほとんどが目的のもので、そうやって精製したプラスミドでワークすることが多いと思いますが、その方法を固定化してしまうとわけがわからなくなって来る可能性もあります。大腸菌に悪さするような配列が入っている場合は、一回めでデリーションが起こったものがドミナントになったりもします。 シングルクローンを拾うことは、何らかのコンタミがあったとしてもそのクローンからプラスミドが取れればそのクローンに関しては否定できますが、全体から取ってコンタミのグロースが早いと収量が激減したりもするでしょう。

ありがとうございます 削除/引用 No.10895-3 - 2022/10/26 (水) 03:04:36 - salt おおさんへ お返事ありがとうございます。 変異のあるプラスミドの蓄積が起きる、また増幅されるリスクがあるとのことで納得できました。 手順は増えますが半日程度なので、基本プロトコル通りに進めようと思います。 コメントありがとうございます(^人^)

(無題) 削除/引用 No.10895-2 - 2022/10/25 (火) 12:24:28 - おお 良くないですね。とくにshRNAなどinverted repeatなどの繰り返し配列があったりEcoliの生理増殖に悪影響がある場合特に。 そういう方法でプラスミドを精製すると、普通は大多数が変異が入ってないプラスミドで、変異が入ったりしたものがその影に潜んでいるような状態になります。ですからそれで精製してシーケンスをしても目立った変異が検出できません。そのようなプラスミドのふやし方を繰り返すと、そういう変異のあるプラスミドがさらに蓄積していく可能性があります。

プラスミドを形質転換した大腸菌をプレーティング無しで直接培養 削除/引用 No.10895-1 - 2022/10/25 (火) 10:56:08 - salt もし，御経験もしくは予測のつく方がおられましたら，ご意見を伺えれば幸いです． 通常，既にシーケンス済みで単一のプラスミドを増やすのに，DH5aなどのコンピテントセルに形質転換し，抗生物質含有プレートに塗布→翌日そのうちのコロニーを1つピックアップして，LB液体培地で培養→prep，の流れで自分は行っているのですが， 上記の流れで大腸菌に形質転換後に，その大腸菌を全て直接ＬＢ液体培地に加えて培養してprepする（プレーティングを省く），というのはまずいのでしょうか？ shRNAなどを多数のプラスミドをテストする際には上記で行って，ためしにシーケンスを行ってみても，特に目的となるRNAiシークエンスのインサート部位やＵ６プロモーターなどには変異はなかったので，これで予備実験の際はよいかなと考え進めていたのですが，それはよくないとの指摘があったもので… ただ，上記だとまずい理由がよくわからず，もし何かご存じの方がおられましたら，アドバイスを頂ければ幸いです． 何卒よろしくお願い申し上げます．m(__)m

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