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(無題) 削除/引用 No.10886-7 - 2022/10/21 (金) 12:23:17 - mont 私は長期に渡って保存することを想定する場合は、液体窒素で凍らせて−80度で保存しています。溶解したら、検出まで一気にやります。なるべく凍結融解の回数を減らしたいからですが、科学的根拠があるわけではありません。 PVDFメンブレンを室温で乾燥保存、２年後ぐらいにブロットしたらちゃんとバンドが出たことがあって、意外と大丈夫なのだと驚いたこともあります。実験ノートに貼り付けてあったPVDFメンブランを、ふと思いついてリプローブ、リブロットしてみただけで、結果が信用できるかどうかはさておき、なのですが。 乾燥したPVDFメンブランの再親水化は、おおさんがおっしゃたのと同様の方法でやっています。 完全に乾燥したPVDFメンブレン（メタノール1分震盪、余分なメタノールをペーパータオルに吸わせて、風乾最低15分。完全に乾かすのがコツ）は、タンパク質がトランスファーされた部分を除いて、本当に疎水性になります。なのでブロッキングをせずに、TBST\PBSTでリンスしてから（リンスしないと一次抗体がメンブレンに吸収されて回収量が減ってしまうので）、いきなり一次抗体を反応させても抗体がPVDF膜に非特異に吸着することがありません。抗体がタンパク質に非特異に吸着するのを防ぐわけではないので、その点は混同されませんよう。なので抗体液には通常通りBSAなどのブロッキング兼安定剤を加えています。 以下のマニュアルの13、14ページを参考にした方法です。https://static.fishersci.eu/content/dam/fishersci/en_EU/suppliers/millipore/Millipore2.pdf 抗体溶液に0.1パーセントTweenを使うと、だんだんメンブレンが透明になっていくのですが（私はいつも4度で一晩、次の日には完全に透明っぽくなります）、ムラになって不安になることもあるのですが、なぜか結果には影響しないようです。 最近はPVAで1分ブロッキングをするようになって、乾燥ブロッキングをすることはほぼなくくなったのですが。 メンブレンをメタノールに浸してから、という従来の方法でも問題ないと思います。

(無題) 削除/引用 No.10886-6 - 2022/10/21 (金) 11:46:52 - G25 やっぱりそうですよね。 で、思い出したんですけど、ミリポアの提唱するウェスタンブロットの迅速法というのがあります。これはブロット後のメンブレンをあえて乾燥させることによって、タンパク質の乗っているところだけが親水性で抗体液と接触し、そうでないところは水を弾き汚れないのでブロッキングをスキップできるし、洗浄も短くていいというんですけど。 https://www.merckmillipore.com/JP/ja/life-science-research/protein-detection-quantification/western-blotting/protocols/q9ib.qB.710AAAFBRP0RRkww,nav

(無題) 削除/引用 No.10886-5 - 2022/10/21 (金) 09:19:17 - おお >[Re:4] G25さんは書きました : > >流して転写して、乾燥させて乾燥したままー２０度で保存してます。 > > PVDF膜だと思いますが、一旦乾燥させると、再び親水化が必要と思います。どうされていますか。 鋭い指摘ですね。NC、PVDFともに乾燥させて保存したりします。 NCの場合はPBSTやTBSTで戻せますので話すこともないですが、PVDFにつきましては以下のようにしています。 余裕がある場合 検出の前日にBlocking bufferに浸して４℃でふっています。徐々に水分が浸透してきて、翌日にはたいてい完全にTransferしたあとと同じようになっています。BlockingはPVPを使用してますが私のやっている範囲ではBlockingがかかりすぎてバンドが見えないということはないです。実は乾燥させるとたんぱくがついてないところは親水性がなく水分を弾くのでバックのシグナルがでないという話があったのでやってみたんだけど、やっているうちに徐々に水が染み込んできてならば、乾燥させてもブロッキング液で親水化させればいいかって言うふうに思うようになったのがきっかけです。 また、メタノールでもう一度親水化し直すこともあります。それでも行けるだろうという感覚は例えばBN-PAGEでPVDFにTransferしたときCBBがバッチリ写ってこれが抗体の反応に良くないらしくて、Transfer後CBBを抜くためにメタノールで処理しないと行けないからです。BN-PAGEはNCに移すとCBBの吸着がひどいようでWBには持ち込めないような話があったように思います。

(無題) 削除/引用 No.10886-4 - 2022/10/20 (木) 20:29:23 - G25 >流して転写して、乾燥させて乾燥したままー２０度で保存してます。 PVDF膜だと思いますが、一旦乾燥させると、再び親水化が必要と思います。どうされていますか。

(無題) 削除/引用 No.10886-3 - 2022/10/20 (木) 12:18:11 - βhj SDS-sample bufferに可溶化して−７０〜８０℃に保存してます。-20℃でもダメじゃないけど、数ヶ月とか時間が経つと徐々に分解とか脱修飾とかが起こることあったのでそれ以来してません。 還元剤入れて、加熱してから凍結保存するか、しないで凍結保存するかは人により考え方が違うのですが、私は後者です。還元剤は時間がたつと酸化などで還元能が低下してS-Sの再酸化とかが起きて泳動パタンがスメアになったりデータが変わることがあるので（−２０℃保存でかつ凍結融解を反復したサンプルで特にこの傾向あり。）、泳動直前に入れて加熱してます。 転写後にメンブレンを水に沈めて4℃で保存しておくことも可能ですが、1週間程度ならば特に問題なくできますが、数週間とかあまり長く置くと抗体との反応性が明らかに低下してきたりしたことがあったので、やるとしても今は数日にとどめています。

(無題) 削除/引用 No.10886-2 - 2022/10/20 (木) 01:19:55 - おお 流して転写して、乾燥させて乾燥したままー２０度で保存してます。 流す前の溶液で保存するならー８０度ですが、長くなるほど劣化しているように思えます（サンプルバッファーでしょりしてても）。 Ureaが６Mぐらい入っている溶液ならー２０度でもさほど影響がなさそうです。

ウェスタンブロッティングでの最も劣化しづらい段階での保存 削除/引用 No.10886-1 - 2022/10/19 (水) 19:38:43 - あ 実験初心者です。細胞から得たタンパク質サンプルをSDS-PAGE、ウェスタンブロッティングしようと思っています。 現在サンプルは-20℃で保管していますが、長い間保存していると劣化して検出できなくなると教わりました。実験を一時的に中断するとしたら、サンプルを泳動、転写させてからメンブレンの状態で保存するのとそのまま凍結保存しておくのとどちらの方が劣化しませんか？ また一般的なタンパク質であればどれくらいの期間、保管可能なのか教えてください。 初歩的な質問で申し訳ありません。 リン酸化したタンパク質を検出したいと思っていて、念の為サンプルにフォスファターゼ阻害剤は入れています。

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