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(無題) 削除/引用 No.10880-5 - 2022/10/18 (火) 21:23:46 - vbんjk 値がブレるというのは実験ごとにdoubling timeが、ある時は12時間、ある時は20時間みたいにブレるということですか。それとも細胞数のカウントがdish/well間でばらつくということ？ 後者なら細胞の播種の段階ですでに均等に播けてないとかはないですか。 MTTは比較する細胞のミトコンドリア代謝が同じで実験で影響受けないという前提なので、それが担保できないと適切な方法ではないです。細胞を剥がすことなくDAPIやヘキストで染色した核の数を機器で自動的に数える方法はあったと思う。死細胞もカウントする欠点はあるけど。

(無題) 削除/引用 No.10880-4 - 2022/10/18 (火) 17:46:42 - asan 血球計算版の自動セルカウンターの場合、古いものだとピント調整などができないので細胞の大きさや入れる液量の微妙な違い、凝集やゴミなどの判別で安定しないものはあります。最近出た機械だと取得した画像でどの細胞を認識してカウントしてるかを表示してピントなどを微調節できる機材もあるので、そういうものだとプライマリー血球細胞などすごく小さいものはパラメーターを調整すれば改善します。 もっとも、自動化する必要がないなら自分でカウントしたほうが早くより直接的だったりもしします。また、細胞増殖と言いますがMTTなどの相対値は厳密には細胞生存率も含まれた値だったりもするので細胞死が混じるような実験の場合はそれを単に増殖と定義してもいいかは議論があります。また、代謝などの原理を利用する試薬の場合は目的によっては不適切と言われる可能性もあります。 以上特に問題ないとする場合であれば、個人的にはMTTよりレザスリン溶液を自作して蛍光で測定するのが一番安定する印象があります。promega等がKitを販売してますが普通にレザスリン塩だけ買って自作溶液中の色が変わるので蛍光用の遮光プレートをその気になれば洗って使いまわしもできるし、3次元培養もできますので、蛍光プレートリーダーが使える環境ならコスト的にも一番いいです。 細胞カウントのためのFACSをやるのは聞いたことはありませんし、スループットに限界があると思います。 https://link.springer.com/protocol/10.1007/978-1-4939-6960-9_1

(無題) 削除/引用 No.10880-3 - 2022/10/18 (火) 07:41:50 - あふ >>自動測定機 TC20のようなものでしょうか？個人的には、まずはTraditionalな血球計算盤で細胞を直接見ることをおすすめしたいです。 本当にその自動測定器は大丈夫なのか 自験例ですが、自動測定器が故障していたことがあります。PBSを充填したスライドを挿入しても、細胞があることになっていました。後日、機械は交換されて、正常に戻りました。 トリパンブルーに変なものは浮いていないか 分注したTBに凝集塊みたいなものが浮いてて結果が狂った、と同僚が申しておりました。

(無題) 削除/引用 No.10880-2 - 2022/10/18 (火) 03:24:27 - おお それぞれ特性がありますので、あなたの実験でそれで大丈夫か言い難いところではあります。 ブレる原因はなにかというところもよく考えたほうがいいのかもしれません。培養の段階でぶれているのであれば他の測定方法でもぶれますし、細胞に毒性があるものとか加えるとブレやすくなるのも事実です。 もしp２００（p２０）のチップを使って細胞を自動測定器ようプレートに移しているなら、p１０００など太めのものを使ってみるといいかもしれません。Hemocytometerのように２箇所あるなら、一箇移したあともう一度細胞の入ったチューブから吸い直してもう一箇所にいれるようにすると、一回の吸い込みのときのブレをいくらか修正できます。

Growth rateの測定 削除/引用 No.10880-1 - 2022/10/18 (火) 03:04:29 - MTT 培養細胞のGrowth rateの測定を行っているのですが、値が非常に大きくぶれます。 具体的には、Tripan blueで自動測定器で測っているのですが、値が大きくぶれます。MTT assayやflow cytometryにするべきでしょうか。

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