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(無題) 削除/引用 No.10876-4 - 2022/10/18 (火) 03:51:48 - おお たんぱくによってタグの位置、スペーサーの有無で特性が変わることがあります。それぞれのケースで違うこともまあまああるのでこうするといいとは言い難いです。 そういう意味ではTAGがない方が安心ではあります。 ＞マテメソを見ると何かすごい難しいことをやっているようで、 おそらく昔からよくやられている生化学的手法の範疇なのでこの機会に勉強してスキルを獲得すればどうでしょうか。His-tagを考えているようですが、His-tagでの精製は他のアフィニティーレジンに比べてそこまできれいにならないので、Ni-Columnの前か後にそういう生化学的精製を入れないと行けないかもしれませんし。

(無題) 削除/引用 No.10876-3 - 2022/10/17 (月) 13:05:38 - 774R タグと目的タンパクの間のリンカーは必要な場合もあれば不要の場合もあるでしょう。市販のベクターでリンカーが含まれるのは、立体障害によりタグとアフィニティー担体の結合が阻害される可能性を減らすためだと思います。マルチクローニングサイトを付与した結果、自動的に生じるという面もありますが。 おそらくタンパクの末端の構造がふらふらしていてフリーならリンカーなしでも問題なかったりしますし、実際にやってみても大丈夫なことは経験があります。 タグが活性に影響を与える懸念があるのなら、精製後にタグを切断除去する方法もありますね。N末にタグをつけた場合、FactorXaなら切断後にリンカー配列を一切含まないようにデザインすることもできます。

(無題) 削除/引用 No.10876-2 - 2022/10/16 (日) 21:33:19 - U1 ＞タグをつける位置によって精製効率や活性に違いは生まれますか？ はい、タンパク質の種類によりますが、劇的に変化することもあります。 ＞先行研究ではある複合体をタグなしで発現させて精製 基本的な確認ですが、この「ある複合体」はあなたの目的タンパク質と同じタンパク質(つまりあなたの目的タンパク質は複合体)ですか？ 同じタンパク質(もしくは相同なタンパク質)ならば、先行研究の手法を頑張って読み解いた方が良いかもしれません。 昔ならともかく現在で、タグ無しで組換えタンパク質を精製する場合はよっぽどの理由があると思います。 自分でタグ付きコンストラクト作って、精製してみたけど活性が無く、タグの種類や場所、リンカーを工夫してみたけど改善できず…となる可能性があるので。。。

タグの付け方 削除/引用 No.10876-1 - 2022/10/15 (土) 17:39:39 - 太郎 リコンビナントタンパク質を作るのが初めてなので、ベクターの設計法について、基本的なことなのですが質問させてください。 目的遺伝子のN末端側にHis-tagをつけて、昆虫細胞で発現させてタグを使って精製し、in vitroで反応させたいと思っています。 この際、タグをつける位置によって精製効率や活性に違いは生まれますか？ in fusionでプラスミドを作ろうと思っているので、好きな位置に入れられると思います。この際、タグと遺伝子の間に余計な配列が多いと邪魔になりそうなので、タグの直下に発現遺伝子の開始コドンを入れるのがベターなのでしょうか？それとも、間にちょっと余裕を持たせた方が精製のためによかったりしますか？ また、先行研究ではある複合体をタグなしで発現させて精製していました。素人考えだと、タグなしで精製するのって難易度が高そうなイメージがあります。これはタグがついていると複合体の形成やタンパク質の活性に問題が出るとの考えからこうしているのでしょうか。マテメソを見ると何かすごい難しいことをやっているようで、同じようにすべきなのか迷っています。

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