BioTechnicalフォーラム [RNA精製キットのトレンド、おすすめ]

(無題)

No.10872-21 - 2022/10/26 (水) 18:58:34 - DNA

RNAに限ってこのメーカーというほど差はあるのかわからないけど
QIAGENが信頼性と再現性と（コスト？）で優位なら
Zymoは地味にプロトコールで差別化しようとしてるきらいがある。
BioLabsもMonarchのカラムが小さいから
溶出量少なく・濃くしたいなら適しているのもあるかもしれない。
キャンペーンで割安になってるなら別メーカー試してみるのもいいかも。

(無題)

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No.10872-19 - 2022/10/21 (金) 01:13:11 - おお

>[Re:18] G25さんは書きました :

> NorthernやcDNA library作成がルーチンだった時代にはAGPC法は画期的なRNA精製法だったんです。プロトコールもDNA除去のケミストリーもソフィスティケートされていて、当時、最上級の精製法だったCsTFA超遠心と遜色ない性能だったのです。

たしかに当初は画期的だったとおもえます。それでRNAの研究が一気に広まったとすればノーベル賞級のような気もしてきます。

>
> >そういえばGEのカラムのキットを使ったことがあるけど、プラスミドを導入して、そのプラスミドから発現するTranscriptsをみる実験をそのキットでやってましたが、そんなに支障が出たことはありませんでした。
>
> その例に限らず、標的RNAが豊富なときはDNA由来の産物が見えてくるまでサイクルを回さないから支障がないんだと思います。
>
> キットによる精製度の違いも、実験で要求される精製度の違いも、程度の問題になってしまいますけど。

おっしゃるとおりだと思います。だからおすすめだとも、優れているとも書かないようにしたつもりです。まあ感覚的には普通のOn column DNase treatmentに適応したキット的な印象です。

(無題)

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No.10872-18 - 2022/10/20 (木) 20:54:51 - G25

>むかしいたポスドクがTrizolでTotal RNAを細胞から精製したとき、TrizolでDNAがのぞけるという謳い文句に騙されて

NorthernやcDNA library作成がルーチンだった時代にはAGPC法は画期的なRNA精製法だったんです。プロトコールもDNA除去のケミストリーもソフィスティケートされていて、当時、最上級の精製法だったCsTFA超遠心と遜色ない性能だったのです。（考案者のChomczynskiが超遠心機がない環境にいたときに、それでもRNAがとれる方法を探求していたそうだ）。
ただ、RT-PCRが主力の時代になって、それでは力不足になってきたというだけで。今でも用途によっては私も使っています。

>そういえばGEのカラムのキットを使ったことがあるけど、プラスミドを導入して、そのプラスミドから発現するTranscriptsをみる実験をそのキットでやってましたが、そんなに支障が出たことはありませんでした。

その例に限らず、標的RNAが豊富なときはDNA由来の産物が見えてくるまでサイクルを回さないから支障がないんだと思います。

キットによる精製度の違いも、実験で要求される精製度の違いも、程度の問題になってしまいますけど。

(無題)

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No.10872-16 - 2022/10/20 (木) 20:39:18 - AA

ダイレクトにcDNA合成に進む場合は夾雑物が反応を阻害するので、多くても数十細胞が投入する限度になるそうです。

1細胞当たり10pg程度と想定してトータルで数十ng、5ul溶出で少なくとも数ng/ulとなるはずですが、アジレントのバイオアナライザでも10pg/ul程度の数値でピークも非常に小さく、正しく溶出できていない印象でした。

(無題)

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No.10872-15 - 2022/10/20 (木) 19:01:00 - たろう

「RNAxsは溶出が5ulでできるということで試したのですがあまり取れませんでした」ということですが、「細胞からダイレクトにcDNA化できるようなキット」を使う場合と同様の方法で投入細胞量(あるいは投入RNA量)を見積もれば、あまり取れなかったわけではないことが判明しそうです。

(無題)

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No.10872-14 - 2022/10/20 (木) 17:15:10 - AA

便乗質問で恐縮ですが、微量のRNAの精製にキットはついて皆様のおすすめはありますでしょうか？

FACSで集めたマウス脳由来細胞を数千個くらいのスタートで、totalRNAをRNAseqへ用いたいと考えています。
マッハライのRNAxsは溶出が5ulでできるということで試したのですがあまり取れませんでした。。

正味かなり厳しそうということで、細胞からダイレクトにcDNA化できるようなキットを使うべきか悩んでいます。

(無題)

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No.10872-13 - 2022/10/20 (木) 08:25:06 - おお

>[Re:10] G25さんは書きました :

>
> アジレントの製品は初めて知りました。吸収したStratagene社がオリジンのようですね。原理的にはよくあるシリカカラム+DNase処理のようですが、デモンストレーションのRTaseありなしのPCR実験例をみると、gDNA由来のバンドが皆無で、他社に抜きん出ていますね。

DNaseするタイプでした。。。DNaseなしでRTPCRに使えるようなキットを作るとか作ったとか聞いていたのでそれかと思ってましたが、、、それとも私が聞き間違えしただけなのか。

ちなみに

400793 Absolutely RNA 96 Microprep Kit642.00 USD

400805 Absolutely RNA Microprep Kit, 50 preps 275.00 USD

400800 Absolutely RNA Miniprep Kit, 50 preps 290.00 USD

USのカタログ上の値段は上記のようです。

そういえばGEのカラムのキットを使ったことがあるけど、プラスミドを導入して、そのプラスミドから発現するTranscriptsをみる実験をそのキットでやってましたが、そんなに支障が出たことはありませんでした。カラムに載せれる容量がそんなに多くなかったかもしれません。
Cytivaになってからどの商品だったか、改良などされたのかよくわからなくなってますが、、、

https://www.cytivalifesciences.com/en/us/shop/molecular-biology/extraction/rna/illustra-rnaspin-mini-kit-p-06266

> あと、QiagenのplusほかDNA除去カラムというので対処している製品もちらほらあるようです。どういう原理でDNAだけ除いてるんでしょうかね。
>

そうですね。私もどういうふうにしてるんだろうとおもいました。

(無題)

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No.10872-12 - 2022/10/19 (水) 16:00:43 - Tany

私のお勧めはコスモ・バイオから購入できるBioElegen Technology社の製品です (https://www.cosmobio.co.jp/product/detail/gmbiolab-product.asp?entry_id=14326)．この会社の製品は良く工夫されていて性能もよいと感じています．例えば植物用用RNA抽出キットではバッファーが二種類用意されており、最適なものを使用することでキアゲンのキットで抽出が難しかったものも問題なく抽出出来たという経験があります．

もともと最も性能の良いプラスミド抽出キットを探す過程でこの会社の製品を知ったのですが、カラム式の格さ抽出キット・精製キット全般の性能が良かったので、研究室のキットはすべてこの会社の製品に揃えてみました．

(無題)

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No.10872-11 - 2022/10/19 (水) 15:29:28 - ww

gDNAの除去について、マッハライ社のNucleoSpin RNA plusで抽出したRNAを検討したことがあります。

RNAをRT無しでqPCRしたところ、beta-actinの定量値がRT有りの場合と比べて千分の1以下だったので、gDNAは完全には除けていないけれど許容範囲だとして使用しています。

(無題)

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No.10872-10 - 2022/10/19 (水) 10:34:40 - G25

Northern blotをよくやっていたころはAGPC法（Trizol)がスケールアップ自在で量が稼げるので重宝しました。poly A+ RNAにして 1 レーンにugオーダーは必要でしたから。ただ、昨今のPCR主力の時代、量よりは質、つまりgDNAの混入がないことを希求します。

RNAsol RTは考案者Chomczynskiのオリジナルブランドで、ISOGENIIは同じレシピのニッポンジーン製品ですね。私がやってもやはり最低限DNase処理なしではRT-PCRには使えません。

アジレントの製品は初めて知りました。吸収したStratagene社がオリジンのようですね。原理的にはよくあるシリカカラム+DNase処理のようですが、デモンストレーションのRTaseありなしのPCR実験例をみると、gDNA由来のバンドが皆無で、他社に抜きん出ていますね。
https://www.chem-agilent.com/contents.php?id=300137
これ本当なら素晴らしい。高級寿司店みたいに値段がでてないですが、今度ディーラーに問い合わせてみようかしら（アジレントの製品は何でもお高いイメージが）。

あと、QiagenのplusほかDNA除去カラムというので対処している製品もちらほらあるようです。どういう原理でDNAだけ除いてるんでしょうかね。

(無題)

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No.10872-9 - 2022/10/19 (水) 08:20:44 - おお

>[Re:8] G25さんは書きました :

> 相分離で分配して精製するのは原理的にやはりgDNAの除去性能が弱いので、目下の実験では見送りです。私はISOGENAでやるならISOGEN IIを使います。相分離でなく上清と沈殿するので操作がしやすく精製度もいいと思います。

わたしはRNAzol RTをつかってます。DNAとたんぱくがペレットになるのでIsogen IIに似ています。中間層をの近くを気にすることがないので（とはいってもペレット付近は少し余裕を持って若干の水溶液は残してますが）。

RTとかいているのでそのままRTPCRしてもゲノムとか大丈夫なのかなぁと少し期待はあるのですがやはりDNase処理はしております。

むかしいたポスドクがTrizolでTotal RNAを細胞から精製したとき、TrizolでDNAがのぞけるという謳い文句に騙されてDNase処理をしなかったらゲノム（だったと思うけどもしかしたらTransfectionしたプラスミド）がガンガンに出てRTPCRで使えるほど除けないことをそれで認識したという話があったかな、、、あれはそれともOn column DNase処理できるカラムだったけ、、、

あんまり役に立ちそうにないことを書いてしまいましたが、
gDNAがのぞけるという謳い文句のカラムのKitもそういう意味では実用でどの程度なのか興味があります。

(無題)

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No.10872-8 - 2022/10/18 (火) 19:16:11 - G25

>今年始め頃から、ISOGENを使ってます。価格と容量（回数）のリーズナブルさ、操作の簡便さ、データの安定性、その後のqPCR等の結果から、今まで使ったkitの中では一番いい感じです。

ISOGENはAGPC法のためのmonophasic reagentですが、
相分離で分配して精製するのは原理的にやはりgDNAの除去性能が弱いので、目下の実験では見送りです。私はISOGENAでやるならISOGEN IIを使います。相分離でなく上清と沈殿するので操作がしやすく精製度もいいと思います。

ところで、gDNAの夾雑が問題になったことはないですか？　なにか追加の除去操作はしていますか。

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No.10872-7 - 2022/10/18 (火) 09:30:46 - ふみ

Trizolの精製途中からキアゲンのカラムに乗せる方法は、おそらく、下記の方法ですよね。
(1) AGPC法のAGPでホモジナイズ
(2) Cを加え混和後に遠心分離
(3) 水層に適当濃度のエタノールを加える。
(4) カラムに乗せて精製
確実にきれいなRNAが取れるよい方法だと感じています。
miRNeasyなどはこの方法が公式手順になっています。

Direct-zol RNA Microprep Kitの手順は上記の(2)と(3)を飛ばして、フェノールごとカラムに乗せてしまうようになっています。これでAGPカラム法と同じような結果が得られるならば、手間が少ないので、言うことなしです。

アジレントのセイセイキットのご紹介ありがとうございます。
興味があります。手間がかからずいい具合に精製できればいいなと思いました。
(プレフィルタカラムの目詰まりが頻繁に起こりそうな気がします。)

(無題)

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No.10872-6 - 2022/10/18 (火) 02:28:20 - おお

>[Re:5] ふみさんは書きました :
> AGPC法のAGPまでやったところでそのままカラムに乗せられるキット(Direct-zol RNA Microprep Kit)が売られていたので、これはよいと飛びつきました。
> 試してみたところ収量に関して満足できなくて、今は使っていません。

アジレントがマイクロアレーを出し始めた頃、精製方法の一つとしてTrizolの精製途中からQiagenのカラムに乗せるというのを紹介していました。これについては別に問題はなかったです。

そのころ、アジレントはDNaseとか使わずにゲノムDNAがのぞけるRNA精製キットをRT qPCRなどを見据えて作るとか作ったとかいってました。いま商品を検索してみたところ、

https://www.agilent.com/en/product/real-time-pcr-%28qpcr%29/real-time-pcr-%28qpcr%29-nucleic-acid-purification-isolation-kits/rna/absolutely-total-rna-purification-kits-232739#productdetails

使用感などはわかりません。評価できる人がいればと思います。

(無題)

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No.10872-5 - 2022/10/16 (日) 13:57:11 - ふみ

AGPC法のAGPまでやったところでそのままカラムに乗せられるキット(Direct-zol RNA Microprep Kit)が売られていたので、これはよいと飛びつきました。
試してみたところ収量に関して満足できなくて、今は使っていません。

今はMACHEREY-NAGELの製品がよいと感じています。
Qiagenに比べてカラムの内側の形状が特によいです。

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No.10872-3 - 2022/10/14 (金) 17:20:18 - G25

>gDNAが除去できるカラムがセットになっているやつ

というのはトラディショナルなRNeasyではなく、RNeasy Plusという後継品ですね。情報ありがとうございます。

RT-PCRが重要な手法になって、いろいろな検出方法が高感度化し始め、gDNAのコンタミネーションがクリティカルになってきて、各社DNA除去用のDNaseなんかを競って売り出していた頃の話。キアゲンはRNeasyはエキストラにDNA除去処理をしなくても大丈夫だと、結構強気のうたい文句でした。で結局、夾雑DNA対策で他社に遅れをとった感があります。gDNA除去カラムをつけたRNeasy Plusという製品は、保守的なキアゲン製品のなかで数少ない改良品の例のように思いました。

(無題)

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No.10872-2 - 2022/10/14 (金) 16:35:14 - あふ

私もキアゲンRNeasyを使っていますね（gDNAが除去できるカラムがセットになっているやつ）。ロングセラーで、これからもちゃんと販売が続いてくれないと、再現性の問題が生じるので、ゴチャゴチャいじらず、このまま売り続けてほしいものです。

最近、当局から「SDGsのために、ラボでのプラスチック使用量の削減にも意識を向けてほしい」というメッセージがありました。ラボ長が「取り組む姿勢を見せることも大事かな」というので、下記製品の使用を検討しています。最初は学生の実験系など、ラボの大きな方針に影響しない範囲で、試用するつもりです。

QIAwave RNA Mini Kit
Cat. No. / ID: 74536

RNA精製キットのトレンド、おすすめ

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No.10872-1 - 2022/10/14 (金) 15:55:06 - G25

microarray、RNA-seqtやRT-qPCRの用途でtotal RNA精製するとき、どのキットを選んでますか（AGPC法系は除外。カラムベースの精製法で）。

いままでは昔からひろく使われてきた老舗のキアゲンRNeasyを私も使ってきました。しかし長年、目立った改良もなくずっと続いている製品なので進歩から取り残されているんじゃないか、後発でもっと良い製品が出ているんじゃないかと思うのです（プラスミドやmicrobiome 関連なんかの製品は確実にそうだという感想です）。

Ambion, Zymo などなど目をつけている製品はあるのですが、
みなさんが実際に使っていて、これは優秀だと推薦できる製品があったら教えて下さい。

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