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Dynabeads Biotin Binderのタンパク質精製への流用
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No.10867-TOPIC - 2022/10/13 (木) 17:12:01 - BC
お世話になります。
ご意見伺いたく、トピックを立てさせていただきます。
私は現在、培養細胞からのビオチン化タンパク質の質量分析を行う予定です。
そこでstreptavidin-magnetic beadsを購入すべきですが、ラボにDynabeads Biotin Binderを発見しまして、これを流用できないかと考えています。
これはビオチン化抗体で染めた細胞を分取用だとは理解していますが、原理上、ビオチン化タンパク質の精製にも使えると思うのですが、実際にそれは可能でしょうか?
streptavidin-magnetic beadsを購入すべきでしょうか?
非常に高価な資材になるので、お聞きしたいです。よろしくお願いいたします。
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(無題)
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No.10867-15 - 2022/10/17 (月) 17:14:09 - え
ありがとうございます。
Boiling in SDSに過剰量Biotinならば結構外れるんじゃないかと推察しています。
私の周りの人らはそれで問題なく質量分析してタンパク質同定されていますね。
>[Re:14] ちさんは書きました :
> avidin-biotinの結合はBoiling in SDSでも外れにくく回収率はかなり低いです。検出系の感度にもよりますが少なくてもいいのでとにかく何か検出できればそれでいいということならば、この方法も有効とは思います。
(無題)
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No.10867-14 - 2022/10/17 (月) 15:58:25 - ち
avidin-biotinの結合はBoiling in SDSでも外れにくく回収率はかなり低いです。検出系の感度にもよりますが少なくてもいいのでとにかく何か検出できればそれでいいということならば、この方法も有効とは思います。
(無題)
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No.10867-13 - 2022/10/16 (日) 21:19:16 - U1
過剰量ビオチン+ボイルでも剥がれないことは無いですが、自分がやった時は5%も取れなかった印象でした。
結局自分は加熱を避けたかったのでmonomeric avidin樹脂を購入しました。
こちらはうまくワークしましたが、いかんせん非常に高価…。
散々さんのコメントを見て思ったのですが、ビーズを予め加熱・洗浄して、外れやすいstreptavidinのプロトマーを外してしまうのではどうでしょう?
ビーズとアビジンの架橋がどれだけ均質なのかは分かりませんが、単量体でもビオチンと結合できる(もちろん結合率は下がりますがそれでも十分強い)ので。
あとはmpさんのコメントにある通り、SDS-PAGE + ゲル切り出し
(無題)
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No.10867-12 - 2022/10/16 (日) 18:30:59 - え
興味を持ってこのスレッドを見ていますが、単純に大過剰量のフリービオチンを加えてボイルすれば結構溶出されませんか?私の留学先ではそのようにしていましたが、それで実験を進めてる方が多くいました。
溶出効率が100%かどうかはわからないですが、理論的には競合溶出なら過剰量のビオチンで問題ないかと思っていたので、ここを読んで、その方法はあまり効率がよくないのか?と思いました。
(無題)
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No.10867-11 - 2022/10/15 (土) 01:10:36 - ち
モノメリックアビジンというのがあって4量体のストレプトアビジンよりもビオチンとの結合が緩いので、フリーのビオチンによる競合溶出ができるらしい。アビジンとビーズの間にS-S結合を含むスペーサーを入れることで還元剤で溶出する方法もあるらしい。やっぱ世の中頭いい人いる。
これらの詳細は、Thermoのサイトに丁寧な解説があるので見てください。
(無題)
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No.10867-10 - 2022/10/15 (土) 00:39:36 - 散々
その論文って、つまり、抗体(それが自分で添加した一次抗体であろうと)がコンタミすると如何にMSの実験・解析が困難になるかってことの証左ですよね。beads由来の大量のペプチドがあったらさらに困難になる。
免疫沈降のプロなら成し遂げられるかもだけど、取説に載っているような事を質問しちゃう研究者には到底ムリでしょうね。
>[Re:9] おおさんは書きました :
> 抗体が大量にマジッテいても、ワークします。
>
https://www.nature.com/articles/nprot.2016.020
(無題)
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No.10867-9 - 2022/10/14 (金) 10:29:22 - おお
抗体が大量にマジッテいても、ワークします。
https://www.nature.com/articles/nprot.2016.020
(無題)
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No.10867-8 - 2022/10/14 (金) 10:25:45 - mp
ビーズごとトリプシン処理するとアビジンの消化物が大量に混入するのでMS解析の感度は下がると言われています。これを回避するためアビジンを脱メチル化してトリプシン耐性にすると良い、という内容の論文もありますが結構面倒くさそうです。こういう製品が売られていればいいのですが、、。
ttps://www.embopress.org/doi/full/10.15252/msb.20199370
sample bufferとかで解離させてSDS-PAGEでバンドを回収してMSとかであれば問題ないと思います。
(無題)
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No.10867-7 - 2022/10/14 (金) 10:23:13 - 散々
streptavidinは4量体だから、加熱すれば水素結合が切れて溶け出して来る。
(無題)
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No.10867-6 - 2022/10/14 (金) 09:58:57 - ち
内在性の(生理的な翻訳後修飾としての)ビオチン化蛋白質を精製するということですか。あるいはproteomicsのBioIDをされるのですか。それとも表在性膜蛋白質などをビオチン標識してとってくるということですか。
(無題)
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No.10867-5 - 2022/10/14 (金) 09:04:42 - おお
コバレントにストレプトアビジンをビーズに固定しているのでは?
(無題)
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No.10867-4 - 2022/10/14 (金) 07:50:25 - 散々
加熱するとか還元するとか、過激な条件にbeadsをさらすと、
streptavidinにしろIgGにしろ、beads上のbaitが大量に剥がれてコンタミしてくる。
コンタミのノイズピークを無視して、preyのピークだけを観察できれば良いが、
baitの量の方が桁違いに多いので、出来ない事の方が多いです。
(無題)
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No.10867-3 - 2022/10/14 (金) 02:39:40 - おお
SDS存在下でボイルするとかグアニジンを使うとか剥がす方法はあります。結合しているものを調べるなら剥がす必要もないし。ビーズごとトリプシン処理し、ストレプトアビジンのシグナルを無視して解析するのもできなくはないです。
(無題)
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No.10867-2 - 2022/10/13 (木) 17:56:24 - 散々
取説にそういう用途にも使える、って書いてあります。
Other biotinylated molecules (e.g. peptides/proteins, lectins or nucleic acids) may also be used depending on the target.
でも、beadsから解離させないとMSに使えないと思うけど、その点はどうするつもり?
取説には、ご丁寧に、解離させる用途には、別製品を使えとあるが、MSには不適だろう。
MSに影響ない形でbiotin - streptavidin は解離できないでしょう。
Dynabeads Biotin Binderのタンパク質精製への流用
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No.10867-1 - 2022/10/13 (木) 17:12:01 - BC
お世話になります。
ご意見伺いたく、トピックを立てさせていただきます。
私は現在、培養細胞からのビオチン化タンパク質の質量分析を行う予定です。
そこでstreptavidin-magnetic beadsを購入すべきですが、ラボにDynabeads Biotin Binderを発見しまして、これを流用できないかと考えています。
これはビオチン化抗体で染めた細胞を分取用だとは理解していますが、原理上、ビオチン化タンパク質の精製にも使えると思うのですが、実際にそれは可能でしょうか?
streptavidin-magnetic beadsを購入すべきでしょうか?
非常に高価な資材になるので、お聞きしたいです。よろしくお願いいたします。
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