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(無題) 削除/引用 No.10857-11 - 2022/10/12 (水) 20:10:04 - あの montさん プロトコル詳細をありがとうございます。 急いでいるときや、ストリッピング液を切らしたときなどに使えそうですね。

(無題) 削除/引用 No.10857-10 - 2022/10/12 (水) 08:01:00 - mont >[Re:9] あのさんは書きました : > Mont さん > > 次の具体的なプロトコルを教えてください: > > “ストリッピングをせずに、二次抗体のHRPだけを失活させて（失活したことを確認してから）” １）１％アジ化ナトリウム・TBS中で震盪、室温、１時間 または ２）３０％過酸化酸素水中に静置、３７度で15分　 反応後はTBSTかPBSTで10分３回ぐらい洗浄してから、通常のECL反応でシグナルが出ないことを確認します。次に使う抗体のシグナル強度と同じぐらいの時間、またはそれ以上の時間露光してシグナルが出なければ、HRPは失活したと判断して次に進みます。私は2分ぐらい露光して、あとはコントラストなどを調節して何も見えなければOKとしています。 30％過酸化酸素水は、あまり古いものは使わない方が無難です。パラフィルムの上にメンブレンを置き、その上に盛り上がるように過酸化酸素水を乗せて、37度のインキュベーターに入れます。メンブレンから泡が上がってくるようなら、多分大丈夫です。全く泡が見えない場合は、液が古くて機能していない可能性があるので、新しいのを買いましょう。

(無題) 削除/引用 No.10857-9 - 2022/10/12 (水) 05:30:25 - あの Mont さん 次の具体的なプロトコルを教えてください: “ストリッピングをせずに、二次抗体のHRPだけを失活させて（失活したことを確認してから）” たぶんアジ化ナトリウムあたりを使うのかなと想像していますが、、、最初のHRPが失活したかどうかの確認方法はどのようにすればよいのかが、具体的に教えてください。

(無題) 削除/引用 No.10857-8 - 2022/10/12 (水) 05:16:43 - mont > 理由としては、自分の経験上、一度露光してしまうとストリッピングしても、前のバンドの分だけシグナルが弱くなって定量性が失われてしまうと考えているからです。 > > 別のサイズのバンドを検出なら、ストリッピング後、全く問題ないのですが、、、この考え方正しいですか？ なぜ「前のバンドの分だけシグナルが弱くなる」と考えるのか、私にはよく理解できません。別のサイズだろうが、同じサイズだろうが「ストリッピングの操作がシグナルを下げる」のは正しいと思うのですが。 私はほとんどの場合、シグナルが弱いリン酸化抗体を先に使い、ストリッピングしてから本体の抗体（だいたいシグナルが強い）を使います。 強いシグナルの後に、ストリッピングすると、その後の反応を阻害する、、、というのは知りませんでした。が、リン酸化抗体で、メンブレンの色が変わるほど強いシグナルが出る様なことは滅多にないです（タンパク濃度を下げるか、抗体を希釈するなどして、そのような条件で実験しないこともあります）。 そもそも、白黒はっきりした差がない限り、ウェスタンの定量性についてはあまり期待しないほうがよいかもしれません。実験を繰り返したり、タイムコースをとったりして、独立した複数のサンプルで同じ傾向を示したり、同時に他の実験の結果（生理学的リードアウトの結果など）と合わせて考察するものだ、ぐらいに捉えています。 リン酸化抗体と本体抗体で作製動物種が異なる場合（マウスとウサギとか）は、ストリッピングをせずに、二次抗体のHRPだけを失活させて（失活したことを確認してから）、次の一次抗体を使う方法もあります。非常にシグナルが弱い抗体しか使えない時は、この方法も使います。最初の抗体が、次の抗体の反応を阻害しないという前提なのですが、結果を見れば解ると思います。

(無題) 削除/引用 No.10857-7 - 2022/10/11 (火) 00:51:51 - おお あ、それと指摘がありますように一度検出された場所に近いか重なる位置を違う抗体で検出するときは２回目の検出で検出力が極端に落ちることがあります、特にバンドが非常に強い場合（アクチンとかのレベルで検出できるくらい）。 そういう場合は反応した基質が黄色くなって膜に残ってたりもすることがおおいです。検出できなくなる原因はよくわかりませんが、反応した基質が阻害するのかHRPの反応で生じるROSの仕業なのかよくわかりません。そういう意味でもStrippingをするなら、弱い方を先にするか、検出感度を落とす（抗体の量を下げるとか低感度でルミノールを使ったものとか、ECLPlus以降のものは基質がルミノールでないくそのためか反応した基質が強いシグナルのとき吸着しているのがみえる）と回避できることが多いです。実際の定量性についてはシグナルが見れていてもぶれている可能性は私にはわかりません。

(無題) 削除/引用 No.10857-6 - 2022/10/10 (月) 18:23:37 - G25 あっ、現象に好奇心が湧いて、話が後先になりましたが、 私もブロットをレプリケートして、それぞれ一種類の抗体でやるのを第一選択にします。

(無題) 削除/引用 No.10857-5 - 2022/10/10 (月) 18:19:29 - G25 > 理由としては、自分の経験上、一度露光してしまうとストリッピングしても、前のバンドの分だけシグナルが弱くなって これがよくわからない。ストリッピングすると、結合していた抗体が外れると同時に、膜状のタンパク質全体も剥落するから、2度目の検出は強度が下がるんじゃないの。抗体が付いたタンパク質が選択的に剥がれるわけでもなければ「前のバンドの分だけシグナルが弱くなる」ってことは無いと思う。 あるいは、peroxidase検出だとラジカルで周辺のタンパク質が攻撃されて、抗原性が下がるから、一度目のシグナルが強いほど、リブローブの強度が下がるとか？ だとしたら、他の検出方法にしたらいいかも。 Alk phosとか、蛍光とか。 一次抗体の由来種、クラスによっては蛍光で同時検出も可能かも。 使っている抗標的タンパク質抗体、抗リン酸化体抗体の生物種やクラスはどんなの？ エピトープはオーバーラップしてたりするのかしら？

(無題) 削除/引用 No.10857-4 - 2022/10/10 (月) 13:58:51 - おお タイトルの質問を素直にこたえますと、見えることもまあまああります。かと言って条件を厳しくすると、つぎの検出が難しくなる。

(無題) 削除/引用 No.10857-3 - 2022/10/10 (月) 13:53:18 - おお 違う生物種の抗体であれば、念の為軽くストリッピングやって、アザイドに一晩ぐらい晒してやればたいてい大丈夫ですが、それでもアクチンやGAPDHなど強いシグナルが出る抗体を先にやるとバンドが見られます。ストリッピングされたかどうかは、２次抗体のみで検出してからやればわかります。同種の抗体ならシグナルが弱い方を先にすることで、なんとかなるばあいもおおいです。 いずれにしろ、ストリッピングされたか確認したり、さらに確認して影響がありそうなバンドが出たりするといったことで手間が増えるぐらいならメンブレンをDuplicateしたほうが速いとか思います。

(無題) 削除/引用 No.10857-2 - 2022/10/10 (月) 11:18:21 - VI リプロービングで示さないといけないという決まりはないので、もしきになる点があるならば別々のメンブレンでやってもいいと別に構わないと思います。（仮にそれを指摘する（たぶん少数派と思いますが）レビュアーがもしいたら、そのように説明すればいいだけの話ですし、論文の採否を左右するような事ではないと思われます。）

Westernでストリッピングを行うとバンド見えますか？ 削除/引用 No.10857-1 - 2022/10/10 (月) 00:30:52 - ほー Westernを行っています。 リン酸化抗体と本体の2個を比較しようと思っていますが、ストリッピングを行っていいのか迷っています。 理由としては、自分の経験上、一度露光してしまうとストリッピングしても、前のバンドの分だけシグナルが弱くなって定量性が失われてしまうと考えているからです。 別のサイズのバンドを検出なら、ストリッピング後、全く問題ないのですが、、、この考え方正しいですか？ あるいはしっかり押さえるところを抑えれば、定量性をほぼほぼ維持したまま1枚のメンブレンでウエスタンを何回かは行えますか？

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