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(無題) 削除/引用 No.10856-4 - 2022/10/10 (月) 01:55:04 - 774R あと、固定方法にもよるけど、細胞骨格のような構造は効率よく残るけど、モノマーは一部が漏出して、実質的にも減る可能性がありますね。

(無題) 削除/引用 No.10856-3 - 2022/10/09 (日) 22:17:18 - おお 色んなパラメーターがありそうですけど。 一番単純なのは、モノマーが細胞質に均一に拡散されて存在するならバックグランドと、シグナルの閾値設定が難しいし、ストレスファイバーのような強いシグナルに合わせたとき、ダイナミックレンジないに弱いシグナルが入っているのかってなこともきになる。 ただ、ストレスファイバーとかだとエピトープ部位が複数あり、抗体のエピトープ認識部位が２箇所あることを考えれば、結合の安定性はます可能性はあると思う。実際FLAGと3xFLAGなどでは検出感度が３倍を遥かにこえるらしい。ただし抗体の都合の良いエピトープの配置になっているかは、よくわからない。 一般的には高次構造ではエピトープ部位が隠れたりと検出しにくくなるのを懸念することが多いと思われます。

(無題) 削除/引用 No.10856-2 - 2022/10/09 (日) 22:14:39 - 774R WBだと漏れなく全てのタンパク質が検出されるけど、IFは位置情報に依存する。 ブロードに拡散したものはシグナルとして検出されにくいが、集積したものは目立って見える。 量が変わってなくても特定の構造物に着目して定量したら変化が観察されるでしょう。

蛋白質高次構造と抗体の反応性とIF 削除/引用 No.10856-1 - 2022/10/09 (日) 16:43:41 - 1234 最近気になっていることがあって、ある処理をしたものと無処理の対照群の２つの検体の特定の蛋白質の量を比較定量するという実験において、蛍光抗体法で染色した時の蛍光強度の違いとwestern blottingでのシグナル強度の違いが全然合わないことがありませんか。この前、β-Actinを比べた時、westernではほぼ同じシグナル強度なのですが（アプライ量を少なくしてsaturationしないように注意してます。）IFでは、形態変化がありactinのストレスファイバー形成が誘導された検体の方が顕著に強い蛍光を呈します。細胞内でのその蛋白質がとる３次、４次構造が変化するとそれに応じて抗体との反応性が変わるのではないかと思うのですが、そうした理解で良いでしょうか。

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