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(無題) 削除/引用 No.10852-3 - 2022/10/08 (土) 01:48:55 - おお >もう一つのやり方はそのFLAGTagたんぱく導入のときに薬剤耐性マーカーを使っているでしょうから、導入株を作ったときの薬剤の濃度より高い濃度にさらしてしばらく培養して低発現の細胞を除く。ただどこまでうまくいくかわかりませんので、もう一度FLAGTagたんぱく導入をして、より高い薬剤濃度で選択するほうがベターかも。 まてよ、ウイルス（レトロとかレンチなら）その細胞株に更に感染してMOIを上げる事もできそうだね。

(無題) 削除/引用 No.10852-2 - 2022/10/08 (土) 01:46:20 - おお >Flow等で、分画化することは可能でしょうか？ 蛍光などがないと私には分離できる方法論を思いつきません。染めるには固定しないと多分無理だろうし（よほど今まで殆どやられてない方法論を樹立してやるならべつですが、たとえばFLAGにつくと蛍光活性がでる小分子やたんぱくなど）。 それとも蛍光などなしに何らかの特徴でピックアップすることを考えているのですか。 一つだけ思いつくのは、リポーター(その蛋白の下流で動く遺伝子のプロモーターとか）をTransientに導入してリポーターの蛍光などのシグナルで分けるというやり方ですが、すべての細胞に一様にリポーターが入るわけではないのでどうだろう、ルシフェラーゼアッセイのように導入効率補正ができる工夫が必要かもしれません。 もう一つのやり方はそのFLAGTagたんぱく導入のときに薬剤耐性マーカーを使っているでしょうから、導入株を作ったときの薬剤の濃度より高い濃度にさらしてしばらく培養して低発現の細胞を除く。ただどこまでうまくいくかわかりませんので、もう一度FLAGTagたんぱく導入をして、より高い薬剤濃度で選択するほうがベターかも。

Flagタグ融合タンパク質を強発現している細胞の選別 削除/引用 No.10852-1 - 2022/10/08 (土) 01:19:50 - JSS ウイルスを使って、Flagタグ融合タンパク質のpolyclonalな安定株を作成しました。 特定の1細胞を解析するとバイアスがかかる可能性があるため、polyclonalな状態を維持したままで、Flag融合タンパク質を強発現している細胞を選別したいと考えています。 細胞質に存在するタンパク質を導入しているのですが、Flow等で、分画化することは可能でしょうか？ あるいは何か他にいいアイデアはありますでしょうか。

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