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(無題) 削除/引用 No.10837-16 - 2022/10/04 (火) 23:27:54 - mont 問題解決した様でよかったですね。 他の方からプラスミドをもらったら、よほど信頼できる相手からでない限り、実験と並行してシークエンスした方が無難です。過去の学生の遺物の場合、経験上ほぼ半分の確率で間違いがみつかるんじゃないか、というくらい信用できません。また、みんなが使ってるから大丈夫、、、ということもありません。自分の目と手で確認するのが一番で、まずは疑ってかかる方が最終的には早道だなと経験上思います。 もう一つ。 他の方から細胞をもらったら、信頼できる相手からでも、実験と並行してマイコプラズマの検査をしましょう。経験上、他人から貰った細胞の３割以上でマイコプラズマが検出されます。定期的にマイコプラズマチェックしているはずでも、です。

(無題) 削除/引用 No.10837-15 - 2022/10/04 (火) 14:19:28 - 制限酵素 plasmidはラボに過去に在籍していた人が残していったもので、タンパク質の一部をコードしているもので、軽く情報が記載されていますが、おっしゃるように間違いがあるかもしれません。sequenceは確認していません。 ご指摘を受けて、別の人が残したplasmidの他のものを制限酵素処理したら、double digestionができました。plasmidの不具合だった可能性が高いですね。。 double digestionは手抜きの方法で、基本の基本は一方の制限酵素でcutした後、bufferを変えたり塩濃度を足して、他の制限酵素でcutするというご指摘は、恥ずかしながらその発想がありませんでした。 plasmidの不具合という結末でしたが、皆さんからのご返信で大変勉強になりました。ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.10837-14 - 2022/10/04 (火) 09:42:03 - G25 確かに、、、 no insert なら辻褄が合ってしまう。

(無題) 削除/引用 No.10837-13 - 2022/10/04 (火) 04:10:03 - mont その270-80bpの断片がPlasmid中にあることは、どうやって確かめたのですか？ シークエンスの結果？他の制限酵素で切った結果から推定？ 他の方から譲渡されたプラスミドの場合は、ちゃんとインサートが入っているかシークエンスしてから使った方がよいですよ。 かなりの確率で変異が入っていたり、マップと違うじゃん、、、ということがありますので。 ご自分でシークエンスされて確認済みなのでしたら、どこか技術的な問題なのでしょうか。。。 なんとなーく、実は空ベクターで、そもそも断片が入ってなかったりして、というオチを勘ぐってしまいます。そのチューブはの中身は絶対にマップ通りの正しいものだと確信ありますか？

(無題) 削除/引用 No.10837-12 - 2022/10/04 (火) 02:31:18 - おお 何が起こっているかわからないけど、あなたの観察が確かなら（そうであるかはデーターを見ないと判断できないので）、実際に切れてないわけだし、工夫をする必要があるということだけは言えると思います。 ステップワイズにやるのが私は理想的だと思います。とくにKpnは塩濃度にセンシティブなようで、Universalとうたっているバッファーなどでも明らかに活性は落ちていると思われます。 KpnIでカットして確認後、念の為エタ沈してXbaIで切るというのがいいと私は思います。 いま添付されるバッファーなどどうなっているかわかりませんが、KpnIはそれに最適なバッファー（NEBなら １、プロメガはJかな、ニッポンジーン（多分タカラもかな）とかならLだったとおもう）をつかってください。 メーカーによってはKpnIの場合塩が入ってないバッファーなので、KpnI処理したあとXba Iのバッファーを加えればOKみたいな裏技的なこともあるのだけど、うまく行ってないという現状やめたほうがいいと思う。 酵素を増やすというのはある程度までありと思いますが、DNA量にたいして４倍過剰ぐらいまでにしておいたほうがいいと思う（人によっては１０倍過剰位入れているかも）。グリセロールの持ち込みを考えると十分の１量ぐらいしか入れれないけどね。それでも１０Uぐらいだから数マイクログラム切るには十分。 切れているということなのでそれはないと思いますがXbaIはメチレーションセンシティブでそこは確認してますか？

(無題) 削除/引用 No.10837-11 - 2022/10/03 (月) 09:31:12 - いいいい 単カットの時とdouble-digestionの時のバッファを同じにしておけば、どっちで切れていないかはわかりますね。

(無題) 削除/引用 No.10837-10 - 2022/10/03 (月) 01:02:10 - 774R そもそもKpnI-XbaI間に270-280のインサートすら入ってない可能性もありえますね。プラスミドの由来が書かれてないから分からないけど、大外で切ってみたり、違うパターンで切ったりして確認してもよいかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.10837-9 - 2022/10/02 (日) 22:04:35 - drop 自分がdouble digestionでミスった時は先輩に制限酵素の終濃度に気をつけろと言われたものです まぁ…たぶん本件には関係ないでしょうね、すみません

(無題) 削除/引用 No.10837-8 - 2022/10/02 (日) 21:50:06 - 774R 5560-270=5290　ですが、 5560と5290だとバンドの位置はほとんど同じ。 270は元ベクターの1/20の長さで染色の明るさもも1/20、且つバンドがブロードになりがちなので、単に暗くて見えてないだけかもしれません。 1種類だと切れるのに、同じ条件で2種類の酵素を混ぜると切れなくなるなんて、まともに考えたらありえないでしょう。

(無題) 削除/引用 No.10837-7 - 2022/10/02 (日) 21:24:50 - G25 一般的に、至適塩濃度より低いとスター活性が出やすいが、高いと単純に切れなくなることが多い。 だから低塩濃度の酵素を効かせた後、失活や精製抜きで塩濃度を上げるのはセーフ。 しかし、至適塩濃度より低いところに制限酵素を置くのはスター活性要注意。 一応、Xba1はスター活性はセーフとされているみたいだけど、原則、塩濃度を上げてから加えるのが基本。これもまたXba1はセーフのようだけど、半減期の短い酵素などだと酵素が効かない状態でプレインキュベートされるとその間に酵素活性が減弱する危険性がある。 いずれにせよ、メーカーがカタログの付録なんかで提供している資料をよく読んで反応を組み立てるようにすることを勧めます。最近はカタログ冊子に目を通すんじゃなくて、ネットで検索して目にした情報しか見なさがちなので、周辺情報が疎くなりがち。

(無題) 削除/引用 No.10837-5 - 2022/10/02 (日) 19:59:34 - み 最近は共通のバッファーで消化できる酵素が各社から販売されていますが、昔はKpnIはLow bufferでした。両方の酵素を入れておいても良いけどLowで数時間消化後、高濃度のＮａＣlだけ足して50mM上昇させてさらに数時間消化したら大丈夫です。

(無題) 削除/引用 No.10837-4 - 2022/10/02 (日) 19:26:00 - G25 理屈はどうあれ、実際に二重消化で問題が起こっているのだから、基本に帰って順次消化してみたら。 L buffでKpn1消化->泳動で確認->塩濃度を上げてBuff MでXba1消化->泳動で確認 メーカーの資料で至適バッファが異なる酵素の二重消化の時に推奨されるバッファのテーブルなんてありますけど、あれは100%のパフォーマンスを保証するものではありません。多少の不完全消化やスター活性は生じる可能性はあるけれど、少なくとも一部はちゃんと切れている分子もできるという程度だと思ったほうがいい。基本は至適バッファで順次消化。バッファを妥協して同時消化するのはあくまで手抜き法。

(無題) 削除/引用 No.10837-3 - 2022/10/02 (日) 17:36:22 - 制限酵素 元が5660 bpで断片が270-280 bpですので、移動度が確認できると思います。 また、断片由来のバンドが出ていないというのもdouble digestionが起こっていない証拠だと思います。

(無題) 削除/引用 No.10837-2 - 2022/10/02 (日) 17:23:30 - 774R 単cutとdouble digestionで生じる断片のサイズはそれぞれいくつですか？ そもそも差がある前提になってますが、それは電気泳動で区別できる違いですか？

double-digestionだけうまくいかない 削除/引用 No.10837-1 - 2022/10/02 (日) 17:07:54 - 制限酵素 takaraのKpn1とXba1を1xM bfr中で用いて、あるplasmidをdouble digestionしようとしています。 controlとしてKpnもXbaも加えていないサンプル、Kpnの単cut、Xbaの単cut、double-digestionの4種類をagarose gelで電気泳動したところ、それぞれの制限酵素で単cutした場合はどちらも直鎖状のポリヌクレオチドが得られていました。つまりそれぞれの制限酵素は失活していないということだと思います。しかし、double digestionのサンプルでは単cutと同じバンドがあるのみでした。 このように単cutではうまくいくのに、double digestionは同じ反応温度・時間でもうまくいかないという経験はありますでしょうか。 ありましたら、対処方法をご教授願います。 シンプルに制限酵素量増加・反応時間延長という感じでいいのでしょうか。 （一度やってみようと思いますが他にご意見がありましたらお願いします。）

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