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(無題) 削除/引用 No.10836-10 - 2022/10/04 (火) 10:01:44 - G25 >ウエスタンでバンドが見えないのは百歩譲って、免疫沈降法のタグだけのコントロールには使えますよね? >そもそもタグだけのコントロール実験を、実験に加える価値はありますか？ 正直、私には何を見て何を切り分けるためのコントロールなのかピンとこないのです。 そこが自分のなかでははっきりしていれば、やる価値があるか、使えるかは自明なはずだけどなあ。 意図は良く理解していないですが、他の方も指摘されているように。コントロールに使うのはFLAG単独ではなくFLAGに適当なタンパク質遺伝子を融合させたものを使えばいい、使ったほうがいいと思います。 Sigmaで出していたFLAG融合タンパク質発現/アフィニティー精製系には、FLGA-BAPのベクターがコントロール用についてきたと記憶します。 FLAG断片がほしいだけなら、競合実験やアフィニティカラムからの溶出用などの用途のためにFLAGペプチドは市販されてます（高いけど）。

(無題) 削除/引用 No.10836-9 - 2022/10/04 (火) 01:12:05 - おお >[Re:8] おおさんは書きました : > >[Re:6] kgさんは書きました : > > > 何にもタグには結合しないかもしれませんが。 > > > > そもそもタグだけのコントロール実験を、実験に加える価値はありますか？ > この発想は少し違うと思います。といいますのは例えばIPしたとき、抗体のFc部位に何ならかのたんぱくが結合してないかと問われると（それが理想的にはないとしても）、それを否定するものが必要となります(他にも問われることがあると思います、思考を鍛えるために色々考えてみてください）。また、そういうコントロールを置くとき、なるだけ同じ条件に揃えないと違う条件下でコントロールとして機能するのかという話にもなります。ですからからベクターでTransfectionするという作業をしたり、そのベクターもTestでつかうバックボーンと揃えるというのが常套手段（絶対とはいわない）になるわけです。

(無題) 削除/引用 No.10836-8 - 2022/10/03 (月) 23:47:41 - おお >[Re:6] kgさんは書きました : > 何にもタグには結合しないかもしれませんが。 > > そもそもタグだけのコントロール実験を、実験に加える価値はありますか？ あなたの実験デザインがわからないので、明確にYesというのは戸惑うのだけど、タグのみのからのプラスミドをネガティブコントロールに使う事はよくやられていると思います。少し調べて文献など複数探るとわかることです。 もし、WBで検出できるものにしたいならFLAG tagged gfpなど使えばいいです。

(無題) 削除/引用 No.10836-7 - 2022/10/01 (土) 23:46:28 - x cfvg IP実験ということならば、価値がどうこうとかでなく、それがコントロール実験群になりますのでやっててください。

(無題) 削除/引用 No.10836-6 - 2022/10/01 (土) 23:31:55 - kg 言葉足らずでした。 ウエスタンでバンドが見えないのは百歩譲って、免疫沈降法のタグだけのコントロールには使えますよね? 何にもタグには結合しないかもしれませんが。 そもそもタグだけのコントロール実験を、実験に加える価値はありますか？

(無題) 削除/引用 No.10836-5 - 2022/10/01 (土) 18:47:57 - x cfvg Flag自体は分子量から推察してメンブレンにトラップすることは困難で、Western blottingで検出できる範疇ではないと思います。仮にもし検出できたとしても、あまりに小さすぎてSDSのつき方や、構成するアミノ酸組成の影響を強く受けるので推定分子量の位置に泳動されるかどうかわかりません。

(無題) 削除/引用 No.10836-4 - 2022/10/01 (土) 16:28:32 - kg 共免疫沈降法でのコントロールに使おうと思っていたのですが、それは可能でしょうか？ 〉インサートがないと発現できない設計。 わずかにリンカーだけは、インサートにしたと思います。短いですが。アミノ酸5残基くらいです。

(無題) 削除/引用 No.10836-3 - 2022/10/01 (土) 13:37:43 - G25 小ペプチドはメンブレンに捕捉、固定されにくいので、メンブレンの種類やトランスファの方法によってはすっぽ抜けて検出困難です。

(無題) 削除/引用 No.10836-2 - 2022/10/01 (土) 12:50:08 - おお FLAGの配列からサイズが割り出せるでしょう。１kDaないくらい。３xFLAGでも３kDa。借りに発現してたとしても、通常のSDSPAGEではみえません。まあゲルの濃度が１５とか１８％なら可能性はあるだろうけど。漠然と小さいからと勘ぐりいれてそこで思考を止めずに、やれることもあっただろうに。 あとベクターによっては、インサートを入れない状態では発現できない状態になっていつものもあります。 意識してそういうオリゴペプチドタグのみの発現を見ようとしたことはないですがオリゴペプチドはtripeptidyl-peptidaseのターゲットになるだろうから、発現してたとしても検出できないかもしれない。

Flagタグってウエスタンで見えますか? 削除/引用 No.10836-1 - 2022/10/01 (土) 12:24:28 - kg CMVプロモーターにFlagタグ付きのタンパク質を接続したコンストラクトを細胞に発現させています。 コントロールとしてCMVとFlagのみのコンストラクトも導入したのですが、ウエスタンでバンドが見えません。 分子量が、小さすぎるのではないかと疑っているのですが、通常見えるものですよね？ ゲルは4〜12％のグラジェントです。

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