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(無題) 削除/引用 No.10831-11 - 2022/10/04 (火) 08:42:51 - ふみ pHが影響することが分かる資料は下の論文などでしょうか。 DOI: 10.2144/97223st01 Abs(260nm)はそれほど深刻な影響がなくて、Abs(260nm)/Abs(280nm)への影響が大きいのだと思っていました。

(無題) 削除/引用 No.10831-10 - 2022/10/03 (月) 16:16:43 - おお ナノドロップの核酸の検出限界は、２.５ng/ulぐらいです（たしかDNAで）。 ある程度正確に計るにはその５から１０倍の濃度であることが望ましいと思います。あと溶出バファーが水の場合pHが酸性に偏り大きく誤差を生じることもあるのでそういう場合は測定分の試料にバッファーを加えたほうがいい場合もあります。

(無題) 削除/引用 No.10831-9 - 2022/10/03 (月) 15:43:59 - ema Nanodropの1桁ngはほとんど信頼できないので、私は 電気泳動式のアジレント　バイオアナライザー https://www.chem-agilent.com/contents.php?id=1000976 で測定しています。

(無題) 削除/引用 No.10831-8 - 2022/10/03 (月) 15:34:26 - z 早速たくさんのアドバイスありがとうございます。 お返事が遅くなり申し訳ありません。 測定はnanodropeで行っていました。収量は、血清200μLで行って0.5-1ng/μg程度、血清600μLに増やしてみて2-9ng/μLでした。 ご指摘の通り、血清中のmiRNAがごく微量で工夫が必要と思いました。エクソソームの単離なども調べてみようと思います。

(無題) 削除/引用 No.10831-7 - 2022/10/02 (日) 11:16:41 - ふみ キットが数年前でも問題なく使えています。 収量の判定方法が適切でないのだと思います。

(無題) 削除/引用 No.10831-6 - 2022/09/30 (金) 16:27:55 - noname ISOSPIN Liquid Sample miRNA https://www.nippongene.com/siyaku/product/extraction/isospin-mirna/isospin-liquid-sample-mirna.html ニッポンジーンのこれ、又聞きですけど、 そこそこ取れると聞いたことがあります。 検出はリアルタイムPCRでやっているので、Nanodropとかだと測れないかもですね。

(無題) 削除/引用 No.10831-5 - 2022/09/30 (金) 16:06:48 - おお 質問で示されたキットは血清などから直接精製するキットで、２００ul のサンプルからから大体１０ngぐらいとれるようです。溶出するバッファーの量を考えたら、濃度としては１ng/ulに到達しないほどの量。量を測るには蛍光を使った検出など高感度のものが求められると思います。

(無題) 削除/引用 No.10831-4 - 2022/09/30 (金) 15:38:31 - 774R exosomeなら超遠心で落とせば効率的に濃縮できそうですが、一般的にはどうやってmiRNAを取るんだろう？ 超遠心以外にも試薬を加えて沈殿させたり、サイズを利用して濃縮するキットもあるし、一旦濃縮したほうが良さそうに思えますが。。。

(無題) 削除/引用 No.10831-3 - 2022/09/30 (金) 15:23:24 - おお で、収量はとのように測ってどれくらい？

(無題) 削除/引用 No.10831-2 - 2022/09/30 (金) 15:17:53 - 774R 血清中のmiRNAってexosome中にあると言われてる奴ですか？ そもそも存在量がすっごく少ないイメージを持っているのですが、過去の文献とかでどんな感じですか？

血清からのmiRNA抽出について 削除/引用 No.10831-1 - 2022/09/30 (金) 14:52:24 - z こんにちは。 血清を用いてmiRNA精製・cDNA合成を試みています。 キアゲンのmiRNeasy Serum/Plasma Advanced Kitを用いており、血清の凍結保存およびmiRNA抽出の手順について添付のプロトコール通りに繰り返していますが、何度やっても収量が非常に低くうまくできません。 キットは数年前に購入したもので、試薬の劣化による影響などもあるでしょうか。開封から日がたっているものでうまくいかなかったので、次に、購入してから日は経っているものの未開封のものがあったのでそちらでも試しましたが同様の結果でした。 血清の凍結保存・解凍による影響も考慮し、凍結せず採血直後の検体でも試しましたが同様でした。 うまくいかない原因について何かお気づきの点ありましたら教えていただければ幸いです。よろしくお願いいたします。

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