全5件 ( 1 〜 5 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.10815-5 - 2022/09/27 (火) 09:49:23 - RAS ＞まあその前にたんぱくの安定性（半減期など）をテストすると結論が早いかもしれません。 ＞シクロヘキシミドで蛋白質合成とめた状態にして、当該タンパク質の減り方をウェスタンブロットでタイムコースして、縦軸にシグナル強度、横軸に時間でプロットして傾きとか分解半減期とか比較してみればどうかなと。 なるほど。そういう方向性は見落としていました。タンパク質を大腸菌かcell lineから回収して、何らかのアッセイを行うことや、そもそも、まずは、RNAの量が同じことを確認しようと思っていました。プラスミドコンストラクトがおかしいのではとも疑っていましたので。 自分が、タンパク質の安定性がかかわる根拠を考えている理由の一つに購入してきたWTのコンストラクトと同じ発現量の変異と、劇的に多い変異と、劇的に少ない変異の3種が混在していて、プラスミドがおかしいなら、WT以上にはなりづらいのではないかと愚考しているからです。 このbiorxivの論文見るとシクロヘキサミド使っていますね。 Interplay Between KRAS and LZTR1 Protein Turnover, Controlled by CUL3/LZTR1 E3 Ubiquitin Ligase, is Disrupted by KRAS Mutations 全く同じことをするのは芸がないので、いろいろな方向性を考えたいと思いますが。

(無題) 削除/引用 No.10815-4 - 2022/09/27 (火) 01:34:29 - おお ＞RASで遺伝子変異がタンパク質の安定性に影響すると断言していて、さらにタンパク質の不安定性と結び付けていいのか、確信まではできませんでした。 断言しているか私には判断できませんが、発現量がかわる原因が変異によるものであれば、安定性というSpeculationは普通はすると思いますし、その可能性は高いといえます。 ＞RASで遺伝子変異がタンパク質の安定性に影響すると断言していて、さらにタンパク質の不安定性と結び付けていいのか、確信まではできませんでした。 断言しているか私には判断できませんが、発現量がかわる原因が変異によるものであれば、安定性というSpeculationは普通はすると思いますし、その可能性は高いといえます。 ＞自分のデータがあまりにもクリアなので、何か解釈の間違いがあるのではないかとも、疑っているのですが、 クリアなことがそんなに解釈の障害になるというのがよくわかりませんが、違う可能性がないとまで言い切れないのは確かです。それを漠然と考えずに具体化していくのは研究として大事なことです。 転写活性は同じか mRNAの安定性は変わってないか、 Translationの効率は変わってないか Lysis bufferによる可溶性は変わってないか 変異体の使っている抗体に対する抗原性は変わってないか まあその前にたんぱくの安定性（半減期など）をテストすると結論が早いかもしれません。 また、その変異部位のアミノ酸、RNA配列がなにかモチーフになってないかみてみるのも可能性を見る上で参考になるかもしれません。 まあ、cDNAからCMVなどConstitutiveな発現をして変異体でたんぱくの発現量が変われば、たんぱくの安定性がかわったといったん結論づける（それが正確かどうかはおいといて）ことは多いのかもしれません。 PMID: 31748271 PMCID: PMC6900539 DOI: 10.1073/pnas.1915732116 がん関連だとp５３は変異によって非常に安定になることがありますよね。

(無題) 削除/引用 No.10815-3 - 2022/09/27 (火) 01:19:05 - V8P それぞれの変異タンパク質を発現させて、ある程度の量が発現したら、シクロヘキシミドで蛋白質合成とめた状態にして、当該タンパク質の減り方をウェスタンブロットでタイムコースして、縦軸にシグナル強度、横軸に時間でプロットして傾きとか分解半減期とか比較してみればどうかなと。 でもし分解半減期に差異がありそうならば、MG132とかみたいな各種proteinase inhibitorとか添加してどれで分解が抑えられるかどうか見てみたら、安定性の低下していると思われる当該変異タンパク質がどのproteolysisの経路で分解されてるかもわかる。単純な実験でも結構いろんな重要な情報が引き出せる。

(無題) 削除/引用 No.10815-2 - 2022/09/27 (火) 00:14:17 - おお >[Re:1] RASさんは書きました : > CMVで強制発現させても、変異の影響で大幅にバンドの濃さが変わることはありますでしょうか。 > > Actinでロードしたタンパク質の量が同じことは確認しています。 Rasに限らなければ、あります。 ただしあなたのケースでは、たんぱく自身の安定性でない可能性を１００％否定はできないとは思いますが、それでも、タンパクの安定性がまず挙げられる可能性と言えるでしょう。

変異のタンパク質の不安定性への影響 削除/引用 No.10815-1 - 2022/09/26 (月) 23:37:21 - RAS とある癌におけるRAS遺伝子の変異の意義に関する研究を行っています。この癌では、他の癌で見られる変異とは異なる変異が頻繁に観察されるため、変異のpathwayへの働きかけの違いや何故この癌種では、変異のパターンが異なるかを研究しています。 まずは手始めにCMVで各変異を強制発現させたところ、遺伝子変異ごとにWBのバンド強度が大きく異なり、この現象はcell lineによらずに、観察されることがわかりました。 Protein stabilityとRASの研究はされていて当然ですので、いくつかの検索用語で検索してはみて、自分の結果と矛盾しないような論文は見つかったのですが、RASで遺伝子変異がタンパク質の安定性に影響すると断言していて、さらにタンパク質の不安定性と結び付けていいのか、確信まではできませんでした。 自分のデータがあまりにもクリアなので、何か解釈の間違いがあるのではないかとも、疑っているのですが、CMVで強制発現させても、変異の影響で大幅にバンドの濃さが変わることはありますでしょうか。 Actinでロードしたタンパク質の量が同じことは確認しています。

全5件 ( 1 〜 5 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する 名前  メール  　アドレス非公開    タイトル  本文       設定  クッキーを保存（次回の入力の手間を省けます） 上に上げない（トピックの一覧で一番上に移動させません） 解決（問題が解決した際にチェックしてください） 暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。 送信

---

〔使い方〕 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。

---