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(無題) 削除/引用 No.10809-11 - 2022/09/27 (火) 13:58:06 - G25 市販のフォルマリンあるいはフォルムアルデヒド水溶液は安定剤（重合防止剤）としてMeOHが入っているのが普通なので、持ち込みのMeOHは蛍光タンパク質の退色を招くかもしれない。 ちなみに、持ち込みのMeOHが膜脂質を溶かすので膜タンパク質なんかが抜けてしまって抗体染色できなくなるなんてことはよく言われている。

(無題) 削除/引用 No.10809-10 - 2022/09/27 (火) 13:19:26 - ほ 昔 GFP 発現細胞をさらにパラホルムアルデヒド固定→細胞内染色していた方がいました。 GFPのシグナルの低下がみられたため「GFPがリークしている」と騒いでいましたが、実際には使用しているパラホルムアルデヒド液の pH が不適切で GFP の蛍光が低下していました。おそらく 4% パラホルムアルデヒド溶液を自分でつくるときに NaOH での調整がうまくいっておらず、pHがずれていたのだろうと思われます。 GFP の種類にもよるかもしれませんが、 pH には要注意です。

(無題) 削除/引用 No.10809-9 - 2022/09/27 (火) 12:01:27 - pubmed Comparison of fixation protocols for adherent cultured cells applied to a GFP fusion protein of the epidermal growth factor receptor https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/10213201/

(無題) 削除/引用 No.10809-8 - 2022/09/27 (火) 10:49:31 - G25 マウントした後、カバーグラスの周囲をマニキュアで封じたりすると含まれているアセトンが染み込んで退色するという話も。

(無題) 削除/引用 No.10809-7 - 2022/09/27 (火) 05:01:05 - おお >[Re:5] 学生さんは書きました : > 褪色防止剤入りのマウント剤を使うと随分違います。自作のマウント剤（70%グリセロール＋イソプロピルガレート）では１−２日で褪色してしまいます。 褪色防止剤っていうのは観察時のPhotobleachingを防ぐものだと思いますが、保存時（普通は遮光しているとおもう）の褪色ってあるものなんですか？またそれが防げるのは何によるものでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.10809-6 - 2022/09/26 (月) 10:41:01 - G25 アルコール、アセトンなど有機溶媒系、脱水系の固定だと速やかに死ぬと言われていますね。

(無題) 削除/引用 No.10809-5 - 2022/09/26 (月) 08:45:39 - 学生 基本的には光ります。ナマよりは少し蛍光が落ちますが、レーザーの出力を少しあげれば済む話です。めちゃくちゃ精細なシグナルが必要じゃ無い限り基本的に大丈夫です。 思いのほかとても綺麗に光る場合もあるし、例外的に結構シグナルが低くなる場合もあるので一回やってみるしかありません。褪色防止剤入りのマウント剤を使うと随分違います。自作のマウント剤（70%グリセロール＋イソプロピルガレート）では１−２日で褪色してしまいます。

(無題) 削除/引用 No.10809-4 - 2022/09/25 (日) 21:46:24 - toto 確かにEGFPのような古典的なＧＦＰはアルデヒド固定後ＰＢＳに置き換えると蛍光輝度が2割くらいに低下しますが、最近よく使われる改良型のGFPvariantの輝度の低下はそれほどでもありません。これをさらに改良して固定耐性にした fixation-resistant な蛍光蛋白も、いろいろ出てますよ。あとは固定の条件でも大分違います。 ただ、いずれにしてもおおさんのいわれるように、蛍光蛋白抗体を使って2次抗体で蛍光を増強した方が自家蛍光よりずっと明るいので、私らもそのようにしてます。特に組織では。

(無題) 削除/引用 No.10809-3 - 2022/09/25 (日) 20:49:42 - おお 大抵の固定でシグナルが低下します。場合によっては、GFP抗体で染めるという手段を取ったりすることもあるようです。

(無題) 削除/引用 No.10809-2 - 2022/09/25 (日) 18:25:08 - toto ホルマリンに漬けた時は蛍光を失いますが、ホルマリンを除けば光ります。なぜでしょうね。

GFPやOFPは固定後も光りますか 削除/引用 No.10809-1 - 2022/09/25 (日) 17:16:59 - DCC 細胞の蛍光抗体染色を行う予定です。 CMVで強制発現させたGFPやOFP融合タンパク質は固定後も光るという話を聞いているのですが、これは本当でしょうか？ 固定条件の制限やqualityの低下はあったりしますでしょうか。

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